MicroFab噴墨生物3D打印技術(shù)應(yīng)用于人體皮膚等效物制備

韓國(guó)浦項(xiàng)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程系Sungjune Jung教授團(tuán)隊(duì)通過使用MicroFab Jetlab II噴墨打印系統(tǒng)使生物墨水能夠在皮升水平上提供均勻的細(xì)胞分布，使得真皮上表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分布的更準(zhǔn)確、更均勻。壓電噴墨打印技術(shù)改進(jìn)了表皮層的構(gòu)建步驟，可以為進(jìn)一步的研究提供更多種類的皮膚模型。

介紹

皮膚是我們身體最大的部分，代表性特征是其結(jié)構(gòu)由多層組成。最外層的薄層表皮形成了自己的多個(gè)亞層，從高度組織化的表皮角質(zhì)形成細(xì)胞到抵御入侵者（如生物病原體）的物理屏障，表皮具有保護(hù)作用，而真皮主要由細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和真皮成纖維細(xì)胞組成，發(fā)揮緩沖、傳感、分泌和調(diào)節(jié)等剩余功能。人類皮膚等效物在質(zhì)量、再現(xiàn)性和生產(chǎn)方法方面存在的問題是生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、化妝品和倫理學(xué)等許多領(lǐng)域的挑戰(zhàn)性問題之一，為了解決這個(gè)問題，浦項(xiàng)科技大學(xué)材料科學(xué)與工程系Sungjune Jung教授團(tuán)隊(duì)通過結(jié)合兩種打印技術(shù)來制造具有層狀結(jié)構(gòu)的皮膚等效物。

活細(xì)胞和生物材料的直接打印為3D組織工程和再生醫(yī)學(xué)提供了一種新的解決方案。如圖1所示，利用3D氣動(dòng)微擠壓打印機(jī)將含有人真皮成纖維細(xì)胞（HDFn）的膠原蛋白打印在3.0μm孔的膜插入物上。將打印好的真皮轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，使膠原質(zhì)凝固，培養(yǎng)2周。通過使用MicroFab，Jetlab II噴墨打印人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HEKn）均勻分布在真皮上。經(jīng)過角質(zhì)形成細(xì)胞穩(wěn)定期1天后，進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)，誘導(dǎo)表皮層分化2周。

▲ 圖1 微擠出-噴墨混合打印制作3D皮膚模型。
 

為了測(cè)定真皮的產(chǎn)生，對(duì)比實(shí)驗(yàn)測(cè)試了3種不同的人類皮膚成纖維細(xì)胞：HDFn和Hs68來自新生兒包皮，Detroit 551來自女性胎兒皮膚。與沒有細(xì)胞的真皮層相比（圖2B），HDFn細(xì)胞直到2周才觀察到收縮（圖2A），Hs68細(xì)胞LLI培養(yǎng)7天后觀察到真皮層邊緣出現(xiàn)部分收縮（圖2C），Detroit 551細(xì)胞培養(yǎng)4天后觀察到嚴(yán)重的收縮（圖2D）。綜合上述結(jié)果，本研究中后續(xù)使用HDFn細(xì)胞。

▲ 圖2 根據(jù)不同細(xì)胞類型和細(xì)胞數(shù)量對(duì)真皮生物墨水的比較。

為了保證噴墨打印的穩(wěn)定性，研究了細(xì)胞濃度對(duì)噴射行為的影響。HEKn細(xì)胞在生物墨水中的濃度從6.0×106 cells/mL到2.0×107 cells/mL不等。如圖3A所示，在濃度為6.0×106 cells/mL和1.2×107 cells/mL時(shí)，細(xì)胞噴射特性穩(wěn)定，無噴嘴堵塞，然而，在濃度為2.0×107 cells/mL的表皮生物墨水中，無法實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定和連續(xù)的液滴形成。為了確認(rèn)噴墨過程中表皮層液滴數(shù)量合適，計(jì)算了實(shí)際打印的細(xì)胞數(shù)量，如圖B-C所示，在玻璃基板上打印200個(gè)連續(xù)的點(diǎn)，在濃度為1.2×107 cells/mL時(shí)，單個(gè)液滴平均含有6.6個(gè)細(xì)胞，而在濃度為6.0×106 cells/mL時(shí)，僅含有2.0個(gè)細(xì)胞。考慮到后期打印時(shí)的不適條件暴露，故后期選擇液滴中細(xì)胞數(shù)量更多的1.2×107 cells/mL進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

▲ 圖3 壓電噴墨的液滴觀察和角質(zhì)形成細(xì)胞打印密度控制。

此外，研究了微擠出和噴墨印刷對(duì)皮膚細(xì)胞活力的影響，如圖4所示，測(cè)量了膠原中HDFn細(xì)胞的活力，打印組（91.75%）和移液組（95.75%）HDFn的生存力差異可以忽略不計(jì)，打印后5周真皮成纖維細(xì)胞的存活率超過90%，在打印和培養(yǎng)過程中，沒有發(fā)現(xiàn)任何一種皮膚細(xì)胞類型的嚴(yán)重細(xì)胞損傷。

▲ 圖4 打印和長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞活力測(cè)試。

為了測(cè)試角質(zhì)形成細(xì)胞在真皮層的分布，在打印和手動(dòng)移液后立即對(duì)沉積的角質(zhì)形成細(xì)胞層進(jìn)行組織學(xué)染色，獲得橫切面圖像。在噴墨打印的皮膚中，觀察到真皮腫塊上均勻分布的薄層（圖5A）；然而，在手工生成的皮膚中反復(fù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞聚集的不均勻?qū)樱▓D5B）。在角化細(xì)胞沉積后，發(fā)現(xiàn)使用噴墨打印的角化細(xì)胞擴(kuò)散區(qū)域保持在最初打印區(qū)域附近，而移液生成的區(qū)域是最初移液區(qū)域的兩倍多（圖5C）ALI培養(yǎng)后，觀察到噴墨打印的皮膚上層相對(duì)均勻增厚（圖5E）；然而在移液生成的皮膚中，產(chǎn)生了不均勻的增厚層（圖5F）。這種差異與表皮兩層角質(zhì)形成細(xì)胞分布的差異在很大程度上是一致的（圖5G和H）。

▲ 圖5 噴墨打印及移液生成的表皮層對(duì)比。

ALI培養(yǎng)期結(jié)束后，成功獲得了多層皮膚，皮膚模型顯示了豐富的ECM層，在真皮層的頂部觀察到廣泛的角質(zhì)形成細(xì)胞形成上表皮層，組織學(xué)圖像顯示出與真實(shí)皮膚的層狀結(jié)構(gòu)相似的輪廓，如圖6A所示。由于人體皮膚的每一層都表達(dá)了體內(nèi)的特定蛋白質(zhì)，使用特定抗體的免疫熒光染色可以揭示皮膚組織中功能標(biāo)記物的表達(dá)。圖6B-E的結(jié)果表明，打印皮膚由真皮層、基底膜和中間狀態(tài)的分層表皮層組成。
 

▲ 圖6 打印的3D皮膚等效物的組織學(xué)染色和免疫化學(xué)分析。

結(jié)論
通過將氣動(dòng)微擠出和壓電噴墨打印結(jié)合，產(chǎn)生了一種具有多層的皮膚結(jié)構(gòu)，包括富含膠原蛋白的下層（真皮）、中間層（真皮和表皮之間的基底膜）和薄分化的上層（表皮）。表皮層的均勻分布是皮膚組織生成的關(guān)鍵考慮因素之一，通過使用MicroFab Jetlab II噴墨打印系統(tǒng)使生物墨水能夠在皮升水平上提供均勻的細(xì)胞分布，使得真皮上表皮角質(zhì)形成細(xì)胞分布的更準(zhǔn)確、更均勻。壓電噴墨打印技術(shù)改進(jìn)了表皮層的構(gòu)建步驟，可以為進(jìn)一步的研究提供更多種類的皮膚模型。

參考文獻(xiàn)：
[1] Hrl A ,  Ju A ,  Sk B , et al. 3D microextrusion-inkjet hybrid printing of structured human skin equivalents - ScienceDirect[J]. Bioprinting, 22.