腸道的發(fā)育、結構和功能及腸道類器官培養(yǎng)體系的設計思路
上一節(jié)我們聊到其他各種模型方案各自的缺陷，包括難以形成特定的生理結構、無法發(fā)揮相對應的功能、形成的信號通路與人體不一致等。因此類器官培養(yǎng)體系的一大重點便是了解目標器官在體內的結構，盡可能完整的還原其在身體中的生長環(huán)境以及信號通路。
本篇將以腸道類器官為例，為大家簡要介紹腸道的結構與功能。
腸道在功能和解剖學上分為小腸和大腸。小腸由十二指腸、空腸和回腸組成，而大腸由盲腸（包括闌尾）和結腸組成，結腸可進一步分為升結腸、橫結腸、降結腸和乙狀結腸。
圖（A）（B）（C）小鼠腸道準備流程
腸道最主要的作用是從攝入的食物中吸收營養(yǎng)，其吸收功能主要由腸上皮吸收細胞膜刷狀緣中的特定營養(yǎng)轉運體介導（Daniel and Zietek，2015)，其中一些轉運體還可運輸藥物（Daniel and Kottra，2004)，功能上，食物消化后營養(yǎng)和礦物質的攝取發(fā)生在小腸。因此，大多數(shù)營養(yǎng)轉運體在十二指腸及空腸中表達（Wuensch et al.2013; Yoshikawa et al.2011)。腸道相關淋巴組織（gut associated lymphoid tissueGALT）在回腸聚集形成所謂派爾集合淋巴結（Peryers patches)，體現(xiàn)了腸道作為免疫器官的重要作用，而大腸主要負責液體的吸收，且容納了絕大多數(shù)的腸道微生物。
幾乎整個胃腸道均起源于內胚層。在胚胎發(fā)育期間，十二指腸的近端部分（直至膽管入口）由前腸形成，消化道的大部分（從膽管到橫結腸的近端）由中腸形成，橫結腸遠端1/3、降結腸、乙狀結腸及直腸由后腸形成，位于胃腸道黏膜層的腸神經(jīng)系統(tǒng)（enteric nervous system，ENS）調控腸道功能。
胃腸壁本身由4層組成：黏膜層、黏膜下層、肌層及漿膜層（也稱外膜）。最外層也就是漿膜層或外膜，由結締組織組成，包裹肌層及肌間神經(jīng)叢；黏膜下層由包含有大血管、神經(jīng)管及神經(jīng)的結締組織組成，將黏膜連接至肌層，并支持其功能。黏膜層是胃腸道的最內層，可進一步被細分為黏膜肌層（一層薄薄的平滑�。�、固有層（一層包含免疫細胞的結締組織）和上皮層（覆蓋腸道單層上皮細胞，形成宿主及管腔之間的屏障），多數(shù)消化、吸收及分泌過程均通過腸上皮細胞進行。
小腸與結腸的區(qū)別
腸上皮中存在不同亞型的腸上皮細胞：
1）干細胞負責每4—5天不斷更新上皮細胞；
2）潘氏細胞為位于隱窩底部的干細胞龕提供因子，同時分泌抗菌肽；
3）分泌黏蛋白的杯狀細胞可形成覆蓋上皮的黏液，構建物理屏障；
4）腸上皮吸收細胞可吸收營養(yǎng)和離子；
5）EECs可分泌多種激素，控制腸道運動并調節(jié)代謝；
6）含有味覺化學感受器的tuft細胞可參與免疫調節(jié)（Barker，2014)。
需要注意的是，小腸上皮均有隱窩及絨毛，絨毛的長度從十二指腸到回腸逐漸增加；而結腸上皮僅有隱窩，沒有絨毛。
小腸上皮細胞構成示意圖
在正常生理條件下，結腸遠端不存在潘氏細胞，剛才有提到潘氏細胞為位于隱窩底部的干細胞龕提供因子，同時分泌抗菌肽，這表明小腸和結腸的干細胞穩(wěn)態(tài)存在差異。這是小腸類器官培養(yǎng)過程中不需要添加Wnt蛋白，但結腸類器官培養(yǎng)基需要添加Wnt蛋白的核心原因。
①建立器官發(fā)育與形態(tài)發(fā)生模型；
②建立疾病模型；
③再生醫(yī)學/精準醫(yī)學研究。
單個干細胞或分離的腸道隱窩均可培養(yǎng)形成腸道類器官（Sato et al., 2009)。
一、生物微環(huán)境的設計
類器官的體外3D培養(yǎng)需要適當?shù)募毎庵Ъ軄碇С旨毎じ讲⒆鳛槟さ鞍椎呐潴w來觸發(fā)調節(jié)細胞過程的信號，包括存活、遷移、增殖、活性維持和分化成特定譜系。支架是工程化的聚合生物材料，其支持類似于體內微環(huán)境的細胞組織，促進細胞重組為功能性組織，在此期間細胞分泌細胞外基質和酶，允許細胞通過周圍材料擴散和遷移。
分布在各類細胞周圍的基底膜
3D類器官培養(yǎng)主要使用一種膠狀基質（商業(yè)上稱為基質膠），該基質是從Engelbreth-Holm-Swarm肉瘤小鼠腫瘤衍生的細胞系中分離出來的基質基礎上開發(fā)得到的膠狀基質（Liet al.1987)。
目前在全球廣泛使用的品牌是美國康寧公司的Matrigel，由于其壟斷地位及需求的暴增導致產品產能不足，近年中國廈門�；镆餐瞥鐾町a品：Matrigengel，在類器官培養(yǎng)中也被國內外科學家廣泛使用。
模基生物基質膠
這種膠狀基質在1987年第一次被開發(fā)出來。1991年第一次被Aggeler用于乳腺上皮細胞的三維培養(yǎng)，其結構類似于乳腺組織中的腺泡結構（Aggeler et al., 1991)。基于此，基質膠從此成為培養(yǎng)乳腺上皮細胞標準方法中的重要成分。
2009年Hans團隊首先利用基質膠構建了全球第一個類器官：上皮類器官，從此天然基質膠被廣泛用于類器官培養(yǎng)。
二、類器官培養(yǎng)的生長因子的設計
為了成功建立類器官，必須仔細考慮不同的可用方案，除了所需的生物材料基質外，還需要考慮添加細胞培養(yǎng)、增殖及分化所必需的生長因子，從而保證類器官中的干細胞長期生存的能力。這些生長因子模擬生理組織自我更新或損傷修復過程中的干細胞巢環(huán)境，可以通過優(yōu)化培養(yǎng)物生長條件來實現(xiàn)，如提供基底膜基質（即Matrigengel）并添加一系列激動劑（如Wnt和酪氨酸激酶受體）和抑制劑（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白/轉化生長因子－β）。這些生長因子會因所用類器官干細胞的性質而有所差異，研究人員仍在不斷改進生長因子的添加配方，以進一步提高類器官體外存活率。
在類器官中加入必要的生長因子，有助于干細胞在體外更好地增殖分化，從而形成類器官。例如，2009年Hans Clevers實驗室將來自小鼠腸道的腸道成體干細胞接種于基質膠中，并在培養(yǎng)基中添加R-spondin、Noggin、表皮生長因子等干細胞必要生長因子，才培養(yǎng)出了世界首個具有隱窩樣結構的小腸類器官。目前主要在類器官培養(yǎng)中使用的生長因子包括：可支持干細胞增殖分化的生長因子如Wnt-3A、R-spondin-1、Noggin等及小分子抑制劑等。
1.Wnt信號通路相關促干細胞增殖的細胞因子
Wnt-3A是Wnt/β-catenin信號通路的激活因子，可以促進干細胞增殖分化，也在腫瘤發(fā)生中發(fā)揮重要作用。目前，Wnt-3A已被報道用于腦類器官及肝臟類器官培養(yǎng)基，除了Wnt-3A外，R-spondin-1是Lgr5的配體，而Lgr5陽性的干細胞已被證實具有擴增成為類器官的潛能。同時，R-spondin-1作為Wnt信號通路的激動劑，可以通過增強Wnt信號在多方面發(fā)揮作用。因此，在乳腺類器官、小腸類器官、肝臟類器官等多個類器官的培養(yǎng)過程中均發(fā)揮重要作用，是類器官培養(yǎng)中最常見的生長因子之一。
Wnt/β-catenin信號通路
骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(BMP4）是TGF－β超家族的一員，在細胞增殖分化中發(fā)揮重要作用可以抑制Wnt信號，從而控制干細胞的自我更新。BMP4被廣泛用于腸道類器官的研究，調節(jié)腸道內分泌細胞的激素水平。Noggin也是TGF-β超家族的一員，可以與 BMP4、BMP7結合，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白抑制劑的分泌蛋白，與骨形態(tài)發(fā)生蛋白起到相反的作用。Noggin與骨形態(tài)發(fā)生蛋白結合可以協(xié)調 Wnt信號激活干細胞，促進其增殖。因此，Noggin已經(jīng)被廣泛應用于各種類器官的長期培養(yǎng)，如肝臟類器官、小腸類器官及輸卵管類器官。
2.促細胞生長因子
表皮生長因子（epidermalgrowth factor，EGF）主要促進細胞的增殖，已被報道在輸卵管類器官及小腸類器官中發(fā)揮促進類器官生長發(fā)育的重要作用。成纖維細胞生長因子（FGF）可抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白，從而促進類器官生長。目前，F(xiàn)GF2、FGF7和FGF10是最常用于類器官研究的家族成員，對類器官中多種干細胞的增殖分化具有重要的調控作用。血管內皮生長因子（VEGF）不僅在類器官的血管生成及內皮細胞生長中發(fā)揮重要作用，還可以促進腎臟類器官的干細胞增殖，增強心臟類器官的心臟功能，促進腦類器官的神經(jīng)分化等，因此被廣泛用于促進類器官擴增與微環(huán)境調控。肝細胞生長因子不僅可以促進肝臟類器官的形成，還可以維持胃類器官和小腸類器官的生長。
VEGF信號通路
3.小分子抑制劑子
除了上述生長因子，還有各種小分子抑制劑被添加至類器官培養(yǎng)基中，如CHIR99021、Y-27632、A83-01和SB431542，它們通過特異性地阻斷或激活各種信號通路，對干細胞的自我更新和增殖起到重要作用。目前已被添加于多個類器官培養(yǎng)基中，可以防止細胞凋亡并促進類器官形成。
對于小鼠培養(yǎng)體系而言，成熟的腸道干細胞亞群多從Lgr5驅動子后表達eGFP的小鼠中分離提��；而對于人源培養(yǎng)體系而言，胚胎干細胞（embryonic stem cells,ESCs）及誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cells,iPSCs）均可用于腸道干細胞的分離培養(yǎng)（Spence et al., 2011)。根據(jù)所用的實驗方法不同，培養(yǎng)物表現(xiàn)出的特性有輕微差異，干細胞來源的稱為“類器官”(organoids)，而隱窩來源的稱為“類腸道”(enteroids)( Wells and Spence, 2014 )。有研究者為鑒別不同的體外腸道培養(yǎng)物提出了新的命名法（Stelzner et al ., 2012 )，但目前多數(shù)文獻均使用“類器官”統(tǒng)稱這種新型的體外三維培養(yǎng)物。
相較于從隱窩中培養(yǎng)類器官，從單個干細胞培養(yǎng)類器官更復雜、更耗時、更昂貴，且需要特殊的實驗器材。因此，單個干細胞進行類器官培養(yǎng)一般僅用于干細胞生物學研究，而相對簡單地用隱窩進行類器官培養(yǎng)則廣泛應用于其他類型研究。例如，野生型和轉基因小鼠的腸隱窩可進行類器官培養(yǎng)，并作為一種新型的“細胞系”廣泛應用于基礎研究中。此外，從隱窩培養(yǎng)腸道類器官是研究營養(yǎng)和藥物攝�。⊿ato and Clevers, 2013b）以及腸促胰島素激素分泌的最佳模型（Zietek et al .,2015 )。使用標準實驗室設備在幾小時內即可實現(xiàn)以腸隱窩為基礎的類器官培養(yǎng)，商業(yè)化即用型培養(yǎng)基也使得類器官培養(yǎng)更加容易。
廈門�；镄∈笮∧c類器官培養(yǎng)基套裝是一款用于建立和維持小鼠腸道成體干細胞來源小腸類器官的完全培養(yǎng)基。生長在該完全培養(yǎng)基中的小鼠小腸類器官主要由干細胞、腸祖細胞和腸絨毛細胞、潘氏細胞、杯狀細胞和少量腸內分泌細胞組成，在自我更新能力、組織結構、細胞類型和功能方面，小鼠小腸類器官重現(xiàn)了體內小腸上皮的特征。
模基生物小鼠小腸類器官專用培養(yǎng)套裝
參考文獻
