InnoScan 710-IR掃描儀與pGOLD芯片在提高細胞因子檢測靈敏度的應(yīng)用

摘要
細胞因子對細胞信號傳導(dǎo)和免疫系統(tǒng)反應(yīng)至關(guān)重要，在疾病診斷和治療方面具有新的作用 ^{1, 2}。許多關(guān)鍵細胞因子，如白介素 6 (IL-6) 和白介素 1 β (IL-1 β)，血清濃度范圍從飛摩爾 (fM) 到納摩爾 (nM) ^3,4。由于 Elisa 實驗10²-10⁴動態(tài)范圍限制，細胞因子10⁶ 濃度動態(tài)范圍難用傳統(tǒng) ELISA 技術(shù)進行準確評估⁵。 INNOPSYS 的InnoScan 710-IR 掃描儀近紅外檢測和Nirmidas Biotech pGOLD 芯片的金屬增強熒光 (MEF) ，能夠定量檢測10 ⁶ 濃度動態(tài)范圍的白細胞介素 1 β 。
 
 
介紹
 
細胞因子在細胞信號傳導(dǎo)中起著至關(guān)重要的作用，是人體免疫系統(tǒng)狀態(tài)的關(guān)鍵指標。細胞因子檢測可以幫助診斷一系列疾病，包括心血管疾病⁶和呼吸疾病⁷。細胞因子是小分子蛋白（大小為 5-20 kDa），表達濃度從亞 pg/ml⁸ 到數(shù)百 ng/ml³。目前廣泛使用的檢測技術(shù)，包括 ELISA 和微球技術(shù)，檢測下限為 ~1 pg/ml，難檢測低濃度細胞因子。同樣，大多數(shù) ELISA 和其他測定技術(shù)傾向于在可見光區(qū)域檢測信號，因生物樣品呈現(xiàn)高內(nèi)源性自發(fā)熒光，限制了其靈敏度。血清和血漿中的一些細胞因子缺乏可靠量化影響其用作診斷性生物標志物。

一般檢測儀器有兩方面的局限：首先，檢測儀器缺乏低背景所需的波長，其次，對于低濃度生物標志物的檢測不夠靈敏。INNOPSYS 的InnoScan 710-IR 掃描儀，具有10⁶動態(tài)范圍，且能以670nm 和 785 nm掃描紅和近紅外 (NIR) 熒光信號。在這個熒光區(qū)域，內(nèi)源性自發(fā)熒光低，能提高檢測靈敏度。同樣重要的是，近年來能夠進行生物分子偶聯(lián)的高量子產(chǎn)率近紅外熒光染料的數(shù)量也在增加。
 
Nirmidas Biotech, Inc. 將一種稱為 pGOLD 的等離子芯片技術(shù)商業(yè)化，該技術(shù)可將熒光信號放大 100 倍，從而能夠檢測更低濃度的生物標志物 ^8,10-13
 
pGOLD 芯片與傳統(tǒng)蛋白芯片使用相同的實驗方案，具有與標準載玻片芯片相同的形狀，能在紅和近紅外波長最大限度地放大熒光信號。在本應(yīng)用案例中，InnoScan 710-IR 的近紅外掃描功能與 pGOLD 芯片信號放大效應(yīng)相結(jié)合，能檢測亞 pg/ml 濃度的 IL-1 β 。
 
實驗部分
 
功能化的 pGOLD 芯片被分為 8個區(qū)域，每個區(qū)域有三個固定了抗 IL-1 β 單克隆抗體的點，作為捕獲抗體，使用含白蛋白的磷酸鹽溶液(PBS)作為緩沖液。將 pGOLD 芯片的每個區(qū)域與不同濃度的人 IL-1 β 細胞因子在 緩沖液中孵育，濃度范圍從 1 fM 到 1nM 以及一個空白對照。洗滌后，每個區(qū)域與 偶聯(lián)了IR800熒光分子抗 IL-1 β 多克隆抗體進行孵育。 孵育后，洗滌去除游離、未結(jié)合的抗體。使用InnoScan 710-IR儀器進行掃描，激發(fā)波長為785nm。由于樣品點直徑大，PMT 增益設(shè)置為 20，掃描分辨率設(shè)置為 20 µm/pixel； InnoScan 710-IR 能夠?qū)崿F(xiàn)低至 3 µm /pixel的分辨率。
 
 
結(jié)果與討論
pGOLD 芯片金屬增強熒光（MEF）有效放大熒光信號。 MEF 作為一種現(xiàn)象已經(jīng)存在幾十年，近年通過斯坦福大學(xué)的研究進行了優(yōu)化^8,10-¹³，圖 2 數(shù)據(jù)顯示通過 pGOLD 芯片和InnoScan 710-IR
  圖 2：在頂部，通過 pGOLD 芯片和 Innoscan 710-IR 掃描儀檢測IL-1 β 。即使在 1 fM濃度 的 IL-1 β ，也可以看到三個信號點。在底部，平均熒光強度 (MFI) 相對于 IL-1 β 濃度以對數(shù)方式繪制。線性響應(yīng)范圍低于 0.1 pg/ml。

檢測 IL-1 β細胞因子，可實現(xiàn)低至 1 fM 的信號檢測。如圖2所示，InnoScan 710-IR能檢測IR800熒光染料信號，在近紅外波長檢測濃度低于 0.1 pg/ml 的細胞因子 IL-1 β ，同時具備大于10⁵ 動態(tài)范圍。
 
 
參考文獻
 

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