多重免疫熒光/多重免疫組化及腫瘤微環(huán)境系列1：

蛋白質(zhì)水平的多重免疫組織化學(xué)（mIHC）和多重免疫熒光（mIF）能分析、量化腫瘤中免疫細(xì)胞亞群、其功能狀態(tài)及其在腫瘤微環(huán)境中的空間排列等，是目前檢測腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的核心技術(shù)。在準(zhǔn)備開展mIHC/mIHC時樣本數(shù)量、多通道成像、預(yù)算和是否有圖像分析能力是重點考慮的事情。由于所有多重免疫組化（mIHC/mIF）都有創(chuàng)建和驗證多種抗體組合的過程，我們南京泰立瑞的建議基本上都是關(guān)于創(chuàng)建一個由10-60個抗體組成的多重免疫組化檢測模塊的。我們提供了一個基于多重mIHC/mIF的初級介紹，整理了關(guān)鍵資料，并概述了計劃和執(zhí)行此類實驗的主要考慮因素，主要受眾是基礎(chǔ)或轉(zhuǎn)化醫(yī)療研發(fā)人員，或準(zhǔn)備開展mIHC/mIF常規(guī)檢測前建立方法學(xué)的臨床病理、檢驗人員。

本篇是mIHC/mIF系列的第一篇，給感興趣者一個整個領(lǐng)域的概況。

領(lǐng)域簡介

腫瘤微環(huán)境（TME）中宿主和腫瘤細(xì)胞有著復(fù)雜交互，包括多種免疫細(xì)胞（T和B淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和不同的髓樣細(xì)胞巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞等類型），具有特異性免疫活性的蛋白質(zhì)表達(dá)，免疫程序性細(xì)胞死亡檢查點蛋白質(zhì)-1（PD-1）/程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）、細(xì)胞因子（如干擾素γ）和基質(zhì)細(xì)胞、血管和成纖維細(xì)胞等，它們都有獨特生物學(xué)意義。其中一些，如PD-L1在腫瘤和/或免疫細(xì)胞的表達(dá)，及治療前腫瘤標(biāo)本中的CD8+數(shù)量、T細(xì)胞浸潤的密度等與腫瘤對免疫反應(yīng)相關(guān)檢查點抑制劑（PD-1/PD-L1抑制劑）的臨床治療反應(yīng)高度相關(guān)。此外，研究腫瘤對免疫治療的反應(yīng)有助于理解免疫治療是如何重塑腫瘤免疫微環(huán)境，理解這些治療的作用機(jī)制和發(fā)現(xiàn)提示早期治療效果的生物標(biāo)志物�；�于這些早期對TME成功研究，引起了人們試圖擴(kuò)展對TME描述的維度和指標(biāo)，旨在識別新的可用于物精確醫(yī)學(xué)的生物標(biāo)志物。

目前具有最大臨床應(yīng)用價值的生物標(biāo)記物來源于與腫瘤直接相關(guān)的細(xì)胞群。外周血免疫細(xì)胞與TME中的細(xì)胞組成相關(guān)性較差，因此，迄今為止，外周血研究對實體瘤免疫治療的價值有限。實體瘤標(biāo)本的研究也也面臨實體瘤組織可用性有限、在石蠟包埋前腫瘤樣本處理的一致性差、標(biāo)記物表達(dá)的空間異質(zhì)性以及圍繞原位檢測復(fù)雜或罕見細(xì)胞表型的挑戰(zhàn)。流式細(xì)胞術(shù)是一種強(qiáng)大的細(xì)胞表型分析方法，但要求新鮮組織、低細(xì)胞產(chǎn)量和空間信息的丟失限制了此類方法的常規(guī)應(yīng)用，目前主要應(yīng)用于外周血的細(xì)胞表型分析。

美國TCGA項目中使用的DNA和RNA組學(xué)方法為探索腫瘤分類以及免疫浸潤的預(yù)后意義提供了大量數(shù)據(jù)集。但這些分析的輸入異質(zhì)性很強(qiáng)，因為樣本包括所有TME細(xì)胞以及一定比例的非腫瘤組織。盡管生物信息學(xué)計算方法已被用于反褶積mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)，因此單個細(xì)胞類型可以進(jìn)行虛擬表達(dá)譜分析，但單細(xì)胞的空間分布信息都丟失殆盡。類似地，單細(xì)胞RNA-seq允許對單個細(xì)胞的表達(dá)譜進(jìn)行表征分析，但也丟失了空間信息。相比之下，免疫組織化學(xué)（IHC）可以區(qū)分TME內(nèi)表達(dá)相同蛋白質(zhì)的不同細(xì)胞類型，并且可以描述其密度和空間分布。IHC還可以提供標(biāo)記強(qiáng)度的定量評估。免疫熒光（IF）較IHC的一個顯著優(yōu)勢是，即能夠檢測更大蛋白質(zhì)動態(tài)表達(dá)范圍。最近的多項研究證實，與DNA NGS測序、RNA表達(dá)譜GEP及單一PD-1 IHC檢測相比，基于mIF/mIHC多種指標(biāo)的腫瘤微環(huán)境（TME）綜合指數(shù)是最好的生物標(biāo)志物, 在預(yù)測抗PD-（L）1治療的客觀反應(yīng)方面比其他方法具有更高的性能。這些發(fā)現(xiàn)強(qiáng)調(diào)了共表達(dá)和空間分布指標(biāo)的潛在生物標(biāo)志物價值。

總之，免疫系統(tǒng)與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用是癌癥預(yù)后和治療的重要特征。蛋白質(zhì)水平的多重免疫組織化學(xué)（mIHC）和多重免疫熒光（mIF）分析是用于量化免疫細(xì)胞亞群、其功能狀態(tài)及其在腫瘤微環(huán)境中的空間排列的技術(shù)，是目前檢測腫瘤微環(huán)境免疫狀態(tài)的核心技術(shù)。行業(yè)普遍認(rèn)為，我們需要mIHC測試腫瘤微環(huán)境來理解患者的免疫原性，就像需要NGS來理解突變類型和突變負(fù)荷，需要液體活檢方法持續(xù)監(jiān)測治療后的反應(yīng)，未來對腫瘤患者進(jìn)行mIHC和NGS聯(lián)合檢測應(yīng)該成為標(biāo)配。

多重技術(shù)可高精度和準(zhǔn)確度展示組織中單個細(xì)胞表達(dá)的2-50個標(biāo)記。mIHC可以通過一次向一張切片上添加多個抗體及標(biāo)記（例如VentanaRoche或Biocare Medical）或使用一次一個抗體的染色、剝離、照相循環(huán)方法來進(jìn)行。mIF技術(shù)有多個平臺，包括可支持4-5重的標(biāo)準(zhǔn)IF分析技術(shù)及可支持6-8重分析的多光譜技術(shù)（Vectra 3.0TM/Polaris）。更高的多重染色方法包括多離子束成像（multiplex ion beam imaging）、飛行時間成像（MIBI-TOF）、成像質(zhì)量流式細(xì)胞術(shù)（imaging mass cytometry-IMC)和數(shù)字空間分析（digital spatial profiling-DSP）等。我們簡要總結(jié)了這些不同方法的基本原則，以及每種方法的優(yōu)缺點（表1、圖1中）。實踐中，每種方法都需要優(yōu)化和驗證。

表一：不同的組織多重免疫技術(shù)的比較


Taube JM, Akturk G, Angelo M on behalf of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC) Pathology Task Force., et al. The Society for Immunotherapy of Cancer statement on best practices for multiplex immunohistochemistry (IHC) and immunofluorescence (IF) staining and validation. Journal for ImmunoTherapy of Cancer 2020;8:e000155. doi: 10.1136/jitc-2019-000155

圖一：不同的組織多重免疫技術(shù)的比較



圖二：使用多種抗體的多重免疫熒光技術(shù)（mIF）獲取高內(nèi)容成像數(shù)據(jù)：IBEX法獲得的人腸系膜淋巴結(jié)共聚焦圖像。比例尺（500或100µm）。 抗體標(biāo)記靶蛋白分別為β-微管蛋白3（β-Tub3）、Ⅳ型膠原（Coll-IV）、纖維連接蛋白（Fibro）、層粘連蛋白（Lamin），和波形蛋白（Viment）



目前基于熒光標(biāo)記的多重?zé)晒饨M織免疫mIF/mIHC是探測腫瘤微環(huán)境應(yīng)用最廣泛的技術(shù)，TLR專注于mIF/mIHC的相關(guān)技術(shù)，致力于將免疫染色（mIF/mIHC）、熒光圖像采集和分析的自動化和智能化，研發(fā)用于mIF/mIHC的全自動免疫組化染色機(jī)（TR-Stainer）和熒光全切片掃描儀，其中TR-sWSI-5F熒光掃描儀是一款輕量入門級產(chǎn)品，具備快速5色掃描功能（藍(lán)色DAPI、綠色FITC、黃色TRITC、紅色Cy5、近紅外Cy7），滿足目前免疫熒光組化的絕大多數(shù)臨床需求。而TR-sWSI-MF 的多光譜熒光掃描儀可以將多達(dá)15種顏色和自體熒光彼此得到很好的分離，從而使用戶信心百倍地專注于量化真正發(fā)生的生物學(xué)相互作用，能夠在整個切片上同時觀察和測量組織的細(xì)胞，包括多種細(xì)胞表型。