P4SPR應(yīng)用案例：跨膜蛋白質(zhì)(TM)的作用機(jī)制研究

圖一  果蠅觸角與纖毛放大示意圖
 

盡管這些蛋白質(zhì)具有重要作用，其功能上的精確機(jī)制尚未得到很好的理解。在文獻(xiàn)里許多基于體外生化測(cè)定的研究發(fā)現(xiàn)，這些蛋白質(zhì)有大量的配體和配體結(jié)合區(qū)域。在其他研究中,有證據(jù)表明配體/CD36 蛋白相互作用可能參與調(diào)節(jié)配體在膜上的易位和受體介導(dǎo)的配體內(nèi)化。然而，這些未被發(fā)現(xiàn)的 CD36 蛋白生化特性的相關(guān)性尚未在其原生環(huán)境中得到廣泛驗(yàn)證。

一個(gè)特別受關(guān)注的遺傳學(xué)模型地中海黑腹果蠅已知有14個(gè)CD36樣的蛋白質(zhì)，因此提供了一個(gè)有用的系統(tǒng)來(lái)研究CD36 蛋白質(zhì)在體內(nèi)的功能。其中一個(gè)果蠅 CD36 家族成員稱為感覺神經(jīng)元膜蛋白1(SNMP1)，表達(dá)在嗅覺感知神經(jīng)元(OSN)中，具有檢測(cè)脂源信息素的功能。SNMP1通常存在于昆蟲的樹突狀纖毛中，氣味受體(ORs，圖一) 也位于這里。在OSN中，已知果蠅 SNMP1 的功能是檢測(cè)雄性信息素(Z)-1-八度乙酸 (cis-vaccenylacetate,  cVA) 。缺乏 SNMP1 時(shí)會(huì)降低這些神經(jīng)元對(duì)cVA 刺激的敏感性。因此，SNMP1 在此信號(hào)通路中起著重要的作用，但其作用機(jī)制尚不明確。盡管如此，SNMP1與細(xì)胞外脂質(zhì)配體的相互作用進(jìn)而引發(fā)信號(hào)通路下游反應(yīng)，與哺乳動(dòng)物 CD36 在脂肪味覺感知、病原性細(xì)菌脂質(zhì)、脂蛋白的免疫識(shí)別方面類似1,2。因此，SNMP1 為理解體內(nèi) CD36蛋白提供了一個(gè)相關(guān)的模型。

因?yàn)榫哂袩o(wú)標(biāo)記和實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的特點(diǎn)，表面等離子共振(SPR) 技術(shù)在研究生物分子相互作用時(shí)有明顯優(yōu)勢(shì)。在這篇應(yīng)用筆記里，我們將說(shuō)明如何用 P4SPR 來(lái)研究不同昆蟲信息素和 CD36 蛋白的結(jié)合作用，提供一個(gè)分子遺傳學(xué)，細(xì)胞生物學(xué)，生化，電生理學(xué)和同源建模的補(bǔ)充技術(shù)來(lái)表征SNMP1 的結(jié)構(gòu)功能。最終的目標(biāo)是綜合概述跨膜蛋白在興奮劑的刺激下所顯示的作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)設(shè)置
P4SPR 設(shè)備設(shè)置

圖二  P4SPR與蠕動(dòng)泵相連工作示意圖

USB供電個(gè)人型四通道 SPR (P4SPR) 連接到筆記本后可經(jīng)過(guò)P4SPR控制軟件控制和記錄數(shù)據(jù)。蠕動(dòng)泵模塊可輕松集成到 P4SPR 實(shí)驗(yàn)中，以確保穩(wěn)定的液流到 SPR 芯片上( 圖二) 。實(shí)驗(yàn)開始前需要先把Au SPR芯片插入P4SPR 的流動(dòng)池支架中。PDMS 微流體單元放置在 SPR 芯片頂部，并在 P4SPR 蓋上牢固地施加壓力以避免任何液體泄漏。為設(shè)備進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的設(shè)置流程不多于 5分鐘的準(zhǔn)備時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)程序

圖三   CD36傳感芯片及其與小分子相互作用SPR實(shí)驗(yàn)示意圖

首先Au SPR芯片的表面涂有肽自組裝的單層以結(jié)合帶有His標(biāo)簽的蛋白質(zhì)，其功能類似于Ni-NTA。由于SNMP1的胞外域難以表達(dá)，鑒于結(jié)構(gòu)特征的同源性，本研究過(guò)程使用哺乳動(dòng)物CD36作為結(jié)合研究的替代品。高濃度的 His-tagged 標(biāo)記的CD36蛋白溶液在芯片表面孵育15分鐘后完成CD36的固定 (圖三)。實(shí)驗(yàn)中總共研究了9個(gè)信息素分子與CD36蛋白的結(jié)合相互作用。配體在 PBS 中制備的濃度在亞uM和mM之間。PBS中加入0.1%的二甲基硫氧化物提高疏水配體的溶解度。從固定到分析的每個(gè)SPR步驟都可實(shí)時(shí)監(jiān)控。配體溶液從低濃度到高濃度依次注入。每個(gè)配體的分析時(shí)間是 30 分鐘，其中包括 6 種不同的濃度流經(jīng)P4SPR。SPR 位移在熱力學(xué)平衡后做記錄并繪制，以確定每個(gè)配體的親和曲線。平衡解離常數(shù) (KD)和最大SPR信號(hào)可通過(guò)Matlab擬合 Langmuir 等溫線到親和力曲線來(lái)提取。

結(jié)果和討論
SPR傳感器圖

圖四  SPR傳感圖：法呢醇(濃度:0.29-73.4uM)和cVA (濃度: 0.33-83.7uM) (左)；
(Z)-11-16 烯醛(濃度: 0.18-47.0uM)和乙酸異戊酯(濃度: 0.32-327uM) (右)

SPR 傳感圖的結(jié)果顯示隨著法呢醇，CVA 和(Z)-11-16烯醛濃度增加，SPR 位移也相對(duì)增加。對(duì)于乙酸異戊酯未觀察到 SPR 位移表明與CD36幾乎沒有結(jié)合。

配體濃度-響應(yīng)曲線與 KD 比較
為了比較，我們建立了各種分析物的濃度響應(yīng)曲線。通過(guò)SPR 檢測(cè)，5個(gè)信息素分子顯示與CD36結(jié)合（圖五）。檢測(cè)CVA、法呢醇和(Z)-11-16 烯醛得到的解離常數(shù)和一些已知的CD36結(jié)合肽的檢測(cè)結(jié)果在相同量級(jí)(圖六)³
 

圖五  所示配體的 ΔλSPR 濃度-響應(yīng)曲線，用于計(jì)算相應(yīng)的平衡解離常數(shù)
 

圖六  化合物的 KD 和最大 SPR 信號(hào) (ΔλSPR,max)

特異性和靈敏度
信息素與CD36相互作用的特異性在本文中得到驗(yàn)證。已知僅激活非 SNMP1 表達(dá)神經(jīng)元（乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯或丁酸乙酯）的其他刺激物無(wú)顯著相互作用（圖六），表明了昆蟲信息素與 CD36 外域直接結(jié)合的證據(jù)。此外，P4SPR 對(duì)研究 88-250Da 之間分子量配體的結(jié)合具有足夠的靈敏度。這表明 P4SPR 能夠通過(guò)相關(guān)的表面修飾獲得互作檢測(cè)的特異性，并能檢測(cè)低分子量的小分子。

P4SPR優(yōu)勢(shì)
Affinité instruments 的P4SPR是一個(gè)模塊化、個(gè)人型的多通道分子互作系統(tǒng)，用于提供對(duì)這些跨膜蛋白在信息素刺激下的作用機(jī)制的基本理解。它的模塊化允許與液流傳輸系統(tǒng)輕松集成。多通道特性提高了測(cè)量精度，其靈敏度允許檢測(cè)低分子量的小分子。對(duì)于采用多種方法來(lái)理解生物功能背后的作用機(jī)制的綜合研究，特異性強(qiáng)、靈敏度高且用戶友好的P4SPR 系統(tǒng)非常適合于快速收集SPR 數(shù)據(jù)來(lái)表征結(jié)合相互作用。

結(jié)論
P4SPR 提供的相互作用結(jié)合信息，進(jìn)一步證明了信息素與跨膜蛋白的直接結(jié)合，其是信息素在細(xì)胞內(nèi)的隧道效應(yīng)的主要來(lái)源。P4SPR 為不同信息素和 CD36 的結(jié)合作用和特異性提供了寶貴的信息，進(jìn)一步揭示了其作用機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

【1】Hoebe, K. et al. CD36 is a sensor of diacylglycerides. Nature 433, 523–527 (2005)

【2】Laugerette, F. et al. CD36 involvement in orosensory detection of dietary lipids, spontaneous fat preference, and digestive secretions. J. Clin. Invest. 115, 3177–3184 (2005).

【3】Bolduc, O. R. et al. Modified peptide monolayer binding His-tagged biomolecules for small ligand screening with SPR biosensors. Analyst 136, 3142–3148 (2011).