單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組結(jié)合蛋白質(zhì)組在糖尿病治療中的應(yīng)用

胰島具有復(fù)雜的異質(zhì)性和亞種群，包含異質(zhì)性細(xì)胞、未成熟和成熟的亞群。由于胰島素是血糖的主要調(diào)節(jié)器，大多數(shù)關(guān)于胰島功能障礙的研究都局限于β細(xì)胞。然而，越來越多的證據(jù)強(qiáng)調(diào)了α、β和δ細(xì)胞在葡萄糖穩(wěn)態(tài)中的協(xié)同相互作用^[1-3]。高脂肪飲食（HFD）是導(dǎo)致2型糖尿病的一種常見原因，它會(huì)導(dǎo)致胰島的代償性適應(yīng)，隨著胰島功能損傷加劇，會(huì)使得病人的癥狀加重^[4-6]。目前迫切需要α、β和δ細(xì)胞亞群的細(xì)胞表面標(biāo)志物，以探索肥胖進(jìn)展和糖尿病發(fā)病過程中各亞群的組成變化，以及高脂飲食誘導(dǎo)胰島代謝的適應(yīng)機(jī)制。

 

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科楊濤教授團(tuán)隊(duì)在Diabetologia（IF=10.12）上發(fā)表了題為“Single-cell RNA sequencing combined with single-cell proteomics identifies the metabolic adaptation of islet cell subpopulations to high-fat diet in mice”的文章（點(diǎn)擊文末“閱讀原文”查看文獻(xiàn)）。

 

該研究采用單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）結(jié)合單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，深入闡明了各α、β、δ細(xì)胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態(tài)，為探索胰島內(nèi)分泌亞群在健康和疾病中的命運(yùn)和功能機(jī)制提供了基礎(chǔ)資源。

 

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院付麒、蔣和敏、錢玙為本文共同第一作者，楊濤、徐寬楓研究員為共同通訊作者，華大科技質(zhì)譜平臺(tái)為該研究提供了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析服務(wù)。

 

 

 

研究思路及主要成果

 

圖1 研究流程圖

 

1、小鼠胰島細(xì)胞scRNA-seq

該研究將4周大的雄性小鼠隨機(jī)分成兩組，正常喂養(yǎng)（CD）組和高脂肪飲食（HFD）組，喂養(yǎng)8周，每周監(jiān)測(cè)體重。8周的HFD誘導(dǎo)小鼠明顯肥胖，葡萄糖穩(wěn)態(tài)受損，并誘導(dǎo)胰島素抵抗，HFD導(dǎo)致胰島團(tuán)塊代償性增生，尤其是β細(xì)胞。研究人員利用高通量scRNA-seq分析了15,093個(gè)來自CD小鼠胰島的細(xì)胞和18,906個(gè)來自HFD喂養(yǎng)小鼠胰島的細(xì)胞，并聚成四種主要內(nèi)分泌細(xì)胞，基于主要激素基因表達(dá)進(jìn)行了注釋：4,069個(gè)α（Gcg）、14,108個(gè)β（Ins1）、1,698個(gè)δ（Sst）和666個(gè)PP（Ppy）細(xì)胞。

 

從HFD組與CD組比較的α、β、δ細(xì)胞的差異表達(dá)基因（DEGs）來看，α、β、δ細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工明顯富集，炎癥相關(guān)通路在α細(xì)胞中特別豐富（圖2a），這表明炎癥反應(yīng)對(duì)HFD誘導(dǎo)的代謝應(yīng)激的重要性。在β細(xì)胞中，鈣轉(zhuǎn)運(yùn)和離子通道調(diào)節(jié)途徑排在首位（圖2b），表明其與分泌功能相關(guān)。此外，在β和δ細(xì)胞中，氧化呼吸鏈、能量產(chǎn)生和代謝途徑都顯著富集。在δ細(xì)胞中，其他顯著受HFD影響的途徑是蛋白質(zhì)降解和循環(huán)相關(guān)途徑（圖2c）。

 

圖2 HFD和正常組之間α（a）、β（b）和δ（c）細(xì)胞中DEGs富集的KEGG通路前20位

 

 

2、胰島細(xì)胞亞群的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析

由于mRNA的表達(dá)不能完全反映細(xì)胞或器官的生物活性，全面的蛋白表達(dá)譜在胰島細(xì)胞亞群研究中是必不可少的。然而，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)組學(xué)需要樣本量高，而小鼠胰腺中胰島細(xì)胞數(shù)量有限，流式細(xì)胞儀分類的細(xì)胞亞群產(chǎn)量低。

 

因此，該研究對(duì)胰島細(xì)胞亞群進(jìn)行了單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析。首先，研究人員利用大量胰島樣品的譜庫，在數(shù)據(jù)依賴采集模式下進(jìn)行質(zhì)譜（MS）數(shù)據(jù)采集，鑒定出90,494個(gè)多肽和8,168個(gè)蛋白質(zhì)。接下來，MaxQuant集成的Andromeda引擎識(shí)別了α、β和δ亞群的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)樣本中的蛋白質(zhì)。最終，在36個(gè)胰島細(xì)胞亞群樣本（2種飼料×3種內(nèi)分泌細(xì)胞類型×2種細(xì)胞亞群×3個(gè)重復(fù)）中，研究人員鑒定出6,955個(gè)蛋白質(zhì)和50,245個(gè)肽。

圖3 單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析示意圖

圖4 胰島細(xì)胞亞群間差異蛋白表達(dá)熱圖和富集KEGG通路

 

 

3、RNA測(cè)序技術(shù)結(jié)合單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)闡明各細(xì)胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態(tài)

 

ACE2^low α細(xì)胞可能代表低容量、脆弱和對(duì)HFD應(yīng)激易感性的狀態(tài)

為了探索ACE2為基礎(chǔ)的α細(xì)胞異質(zhì)性的分子特征，在Ace2^low和Ace2^high亞群之間鑒定出379個(gè)DEGs，KEGG分析顯示，DEGs優(yōu)先富集于氧化磷酸化、代謝途徑、α細(xì)胞分泌功能相關(guān)途徑和程序性細(xì)胞死亡、增殖途徑，表明Ace2表達(dá)可以區(qū)分不同功能和生存狀態(tài)的α細(xì)胞。與Ace2^high亞群相比，Ace2^low亞群與α細(xì)胞功能相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，與β細(xì)胞特征相關(guān)的基因表達(dá)上調(diào)。這表明Ace2^low亞群可能代表未成熟的α細(xì)胞，這些細(xì)胞似乎具有β細(xì)胞樣特征。單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)一步分析了ACE2^low α和ACE2^high α細(xì)胞HFD組和CD組之間的DEPs和富集KEGG通路。ACE2^low α細(xì)胞中下調(diào)的DEPs數(shù)量比ACE2^high α細(xì)胞多，且這些下調(diào)的DEPs富集在更多與代謝相關(guān)的通路中。這表明ACE2^low α細(xì)胞更容易受到高熱量應(yīng)激的影響，可能是一組低容量、脆弱的α細(xì)胞，而ACE2^high α細(xì)胞可能代表小鼠的主要功能細(xì)胞群，它們能夠更好地承受高熱量應(yīng)激。

 

CD81^high β細(xì)胞可能代表功能較弱的未成熟β細(xì)胞

為了分析β細(xì)胞的異質(zhì)性，研究將β細(xì)胞聚為9個(gè)簇，并鑒定出前10個(gè)標(biāo)記基因。研究發(fā)現(xiàn)CD81在β細(xì)胞簇中有差異表達(dá)，然后將9個(gè)β細(xì)胞簇分為CD81^low和CD81^high亞群。CD81^low亞群相對(duì)于CD81^high亞群，DEGs和富集的KEGG通路顯示細(xì)胞代謝通路以及一系列應(yīng)激相關(guān)的炎癥通路均顯著富集。關(guān)鍵的β細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Mafa和β細(xì)胞成熟標(biāo)記物在CD81^low亞群中有高mRNA表達(dá)，而未成熟β細(xì)胞標(biāo)記物在CD81^high亞群中有高表達(dá)，這表明CD81^high亞群可能代表了一組功能弱且未成熟的β細(xì)胞。

 

為了進(jìn)一步探索HFD對(duì)β細(xì)胞亞群的影響，F(xiàn)ACS顯示與CD小鼠相比，HFD小鼠中CD81^high β細(xì)胞的比例下降。在CD小鼠中檢測(cè)到869個(gè)上調(diào)和373個(gè)下調(diào)的DEPs，在HFD小鼠中檢測(cè)到707個(gè)上調(diào)和312個(gè)下調(diào)的DEPs（圖5a、b）。CD81^low亞群中與能量代謝相關(guān)的途徑都被下調(diào)（圖5 c、d）。HFD和CD β細(xì)胞的scRNA-seq中，參與這些通路的下調(diào)的DEPs也降低了，結(jié)果反映了轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組的一致性。此外，在CD和HFD小鼠中，與β細(xì)胞成熟和功能維持相關(guān)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PDX1在CD81^low細(xì)胞中相對(duì)于CD81^high細(xì)胞顯著上調(diào)（圖5e、f），在CD81^low細(xì)胞中，內(nèi)吞作用、吞噬體、蛋白酶體和突觸囊泡循環(huán)通路中富集的DEPs大多上調(diào)，表明CD81^low細(xì)胞處于更成熟的狀態(tài)。

圖5 β細(xì)胞亞群功能的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

 

HFD增強(qiáng)了成熟GLUT2^low δ細(xì)胞的功能

盡管Slc2a2（編碼GLUT2）是β細(xì)胞的標(biāo)志基因，但研究人員仍然在scRNA-seq中發(fā)現(xiàn)了一小群Slc2a2相對(duì)高表達(dá)的δ細(xì)胞，因此將δ細(xì)胞分為Slc2a2^low和Slc2a2^high亞群。根據(jù)Slc2a2^low亞群和Slc2a2^high亞群中的DEGs和富集通路，上調(diào)通路與鈣離子和激素分泌有關(guān)，提示Slc2a2^low亞群可能功能更成熟。來自CD和HFD小鼠的FACS分選GLUT2^low和GLUT2^high δ細(xì)胞亞群（每個(gè)樣品3,000個(gè)細(xì)胞）用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，KEGG分析顯示，與β細(xì)胞相似，在CD小鼠中GLUT2^low細(xì)胞中，相對(duì)于GLUT2^high細(xì)胞，氧化磷酸化和阿爾茨海默病通路顯著下調(diào)（圖3c）。CD和HFD小鼠GLUT2^low細(xì)胞中的多種營(yíng)養(yǎng)代謝途徑也顯著上調(diào)（圖3c，d）。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)途徑的內(nèi)吞作用和蛋白質(zhì)加工也是如此，表明GLUT2^low亞群的代謝更活躍。在GLUT2^low δ細(xì)胞中，比較HFD和CD小鼠，代謝相關(guān)通路、鈣信號(hào)通路、胰腺分泌、胰島素和胰高血糖素信號(hào)通路顯著上調(diào)，表明HFD促進(jìn)了GLUT2^low δ細(xì)胞的能量代謝。綜上，GLUT2^low δ細(xì)胞可能比GLUT2^high δ細(xì)胞更具有功能和代謝活性，HFD進(jìn)一步刺激GLUT2^low δ細(xì)胞的功能和代謝。

 

圖6 δ細(xì)胞亞群功能的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定

 

總 結(jié)

ACE2、CD81和GLUT2作為表面標(biāo)記物分別區(qū)分成熟度和功能狀態(tài)不同的α、β和δ細(xì)胞亞群。在HFD誘導(dǎo)的葡萄糖耐受不良中，低容量和未成熟的ACE2^low α細(xì)胞比例隨著功能活躍和成熟CD81^low β細(xì)胞比例的增加而增加。成熟的GLUT2^low δ細(xì)胞功能增強(qiáng)，但比例不變。這些動(dòng)態(tài)變化揭示了胰島在HFD應(yīng)激下的代謝可塑性，這種可塑性適應(yīng)可以通過抑制α細(xì)胞的高血糖效應(yīng)，增強(qiáng)β細(xì)胞的低血糖效應(yīng)，以及增加δ細(xì)胞對(duì)α和β細(xì)胞的調(diào)節(jié)來抵消代謝應(yīng)激，恢復(fù)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。因此，靶向上述標(biāo)志物改變胰島亞群分布，以增強(qiáng)胰島功能可能是治療糖尿病的有效方法。

 

圖7 小鼠胰島細(xì)胞（α、β和δ）亞群在HFD誘導(dǎo)下的胰島功能紊亂

 

科技君點(diǎn)睛

本研究利用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)（scRNA-seq）在HFD誘導(dǎo)的葡萄糖耐受小鼠模型中鑒定α、β和δ細(xì)胞亞群標(biāo)記物，通過流式細(xì)胞儀和免疫染色對(duì)各亞群的比例進(jìn)行分類和評(píng)估，并對(duì)分選細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析，通過蛋白表達(dá)深入闡明各α、β、δ細(xì)胞亞群在葡萄糖耐受不良中的功能狀態(tài)。

 

參考文獻(xiàn)：

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[4] Body-mass index and obesity in urban and rural China: findings from consecutive nationally representative surveys during 2004–18. Lancet. 2021

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