LC-MS和GC-MS兩大質譜聯(lián)用技術共同助力中藥復方成分定性分析

前言

 

2021年07月，武漢大學劉天剛教授課題組聯(lián)合上海交通大學鄧子鑫課題組在Journal of PharMaceutical Analysis期刊發(fā)表的題為 “Qualitative analysis of cheMical coMponents in Lianhua Qingwen capsule by HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS coupled with GC-MS ”（IF：14.026）的研究成果，通過高效液相色譜-Q Exactive Orbitrap質譜（HPLC-Q Exactive Orbitrap MS）和氣相色譜-質譜（GC-MS）兩大儀器分析方法，結合數(shù)據(jù)匹配分析，對連花清瘟膠囊中化學成分進行了鑒定分析，共鑒定表征包括：酚類、酚酸、苯丙烷類、醌類、萜類、揮發(fā)性成分（17種）以及其他類型化學成分共120種，并闡述了一些具有代表性成分（揮發(fā)性成分薄荷醇等在內(nèi)）的裂解途徑和特征片段。

這是第一份通過HPLC-Q Exactive Orbitrap MS和GC MS鑒定連花清瘟膠囊中主要化學成分的綜合報告，本研究的結果可為連花清瘟膠囊的質量控制和標準化提供依據(jù)。

 

基本信息

 

中文標題：高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術對連花清瘟膠囊中化學成分的定性分析

研究對象：中藥復方：連花清瘟膠囊

發(fā)表期刊：Journal of PharMaceutical Analysis

影響因子：14.026

發(fā)表時間：2021年07月

合作單位：武漢大學制藥科學學院，上海交通大學生命科學與生物技術學院

運用生物技術：HPLC-Q Exactive Orbitrap MS和GC-MS兩大質譜聯(lián)用技術

 

研究背景

 

連花清瘟膠囊（LHQW）是一種為治療SARS-CoV-1感染患者而開發(fā)的中成藥。開發(fā)的基礎源于兩個古方：麻杏石甘湯和銀翹散。組方包括：黃芪、甘草、金銀花等11種中藥材，在國內(nèi)被廣泛用于呼吸道嚴重感染的治療。諸多研究表明LHQW具有抗H7N9和H7N1的作用，還有研究表明其對COVID-19也有療效。LHQW已作為國健委員會發(fā)布的新冠肺炎診療指南的代表性中藥處方。然而，LHQW的使用僅限于中國，為了使LHQW被全球接受，必須充分了解其化學成分和作用機制。因此，確定LHQW的化學成分是必要的，從而進一步實現(xiàn)其質量控制和標準化。

 

研究思路

 

研究方法

 

1. 材料和方法

1.1化學品和材料：連花清瘟膠囊，乙腈、甲酸、甲醇、乙酸乙酯、丙酮、正己烷等。

1.2樣品準備：

LC-MS分析樣品：LHQW膠囊原料藥棕色粉末0.4 g，20ML的60%甲醇溶解，超聲30 Min。12000 r/Min離心，取上清0.22 mm膜過濾。

 

GC-MS分析樣品：1g的LHQW被10ML（正己烷、丙酮、乙酸乙酯）萃取劑超聲20Min，12000 r/Min離心，取上清0.22 mm膜過濾。

 

1.3 HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS 分析：HPLC-HRMS; UltiMate 3000 HPLC儀器系統(tǒng)，采用aQ C18柱（2.1 mm*150 mm, 3 mm）柱溫恒定40℃，流速0.2mL/min，進樣量5uL。質譜是ESI離子源的Q Exactive-Orbitrap儀器系統(tǒng)，數(shù)據(jù)采集使用Xcalibur 4.1軟件。兩種掃描模式：全掃描（分辨率70000），DDA模式（分辨率17500，范圍100-1500m/z）用于分析LHQW化學成分。

 

1.4 GC-MS分析：使用配有AS 3000自動采樣器、分裂/無分裂注入器和三重四極桿的TSQ量子XLS質譜探測器的GC氣相系統(tǒng)，色譜柱為TR-5 MS毛細管柱(30 mm*0.25 mm，0.25)。進樣溫度和離子源溫度：250℃。電離能為70 eV。收集50-550m/z 掃描范圍內(nèi)的總離子圖。數(shù)據(jù)采集使用Xcalibur 2.2軟件。

 

1.5數(shù)據(jù)處理和化合物鑒定：LC-QE-MS 獲得的數(shù)據(jù)采用CD 3.0軟件處理，提取ESI正、負模式的分子量、Rt、二級碎片和峰面積的數(shù)據(jù)矩陣，集成到CD軟件中，將二級MS²數(shù)據(jù)與mzVault庫對標。匹配得分大于85分（¼100分）采用。此外，結合文獻報道進行比對，提高化合物鑒定的準確性。

研究結果

 

2.1HPLC-Q Exactive-Orbitrap-MS分析

LHQW膠囊正負離子模式的基峰色譜如圖1所示。利用庫對齊方法，共鑒定出104種化合物，包括生物堿、黃酮類、酚類、酚酸、苯丙素、醌類、萜類和其他植物化學物（見表1）。結合以往的研究，已鑒定的化合物存在于LHQW配方使用的中藥中。未發(fā)現(xiàn)綿馬貫眾植物的化學成分。幾種特定化合物的化合物鑒定如下所述。

Fig 1. 使用HPLC-Q Exactive Orbitrap MS分析在（A）電噴霧電離（ESI）正模式和（B）電噴霧離子化負模式下分析連花清瘟（LHQW）膠囊的基峰色譜圖。

 

2.1.1 黃酮類成分查爾酮B鑒定：化合物71的分子式為C16H14O5，由m/z 285.0760處的[M-H]^-峰建立。對于查爾酮B，MS²光譜與先前報道的相似。MS²光譜和可能的破碎途徑如圖Fig S1A所示。在m/z 270.0530處的峰值表示[M-H-CH3] ^-的形成。m/z 150.0316處的堿基峰歸因于羰基碳周圍基團的裂解產(chǎn)生的片段，隨后CH3單元的損失。在m/z 177.0189處產(chǎn)生峰值的片段如圖Fig S1A所示。mzVault庫的對齊結果(Fig S1B；評分89.9)，該化合物鑒定為查爾酮B，是甘草中存在的一種化學物質。

Fig S1：(A)ESI負模式下查爾酮 B的MS²光譜和可能的片段（黑色）。碎片（藍色）的理論質荷比（m/z）。碎片（紅色）的實驗質荷比（m/z）。分子離子的結構（橙色）。(B)在ESI負模式下，查爾酮 B的實驗MS2光譜(Top)和參考MS2光譜之間的比較（Bottom：來自mzVault庫）。發(fā)現(xiàn)與可能的片段相對應的峰與來自mzVault文庫的峰一致（紅色）。

 

2.1.2萜類化合物獐牙菜苷鑒定：化合物26的分子式為C16H22O9，由m/z 359.1335處的分子離子峰（[M+H]⁺）表示。mzVault庫的對齊結果(Fig S2B；評分96.2)，該化合物鑒定為獐牙菜苷，是金銀花中的一種化學物質。

Fig S2：(A)在ESI正離子模式，sweroside的MS²光譜和可能的片段（黑色）

 

2.1.3醌類化合物大黃素鑒定：化合物97的分子式為C15H10O5，由m/z 269.0454處的[M-H]^-峰建立。mzVault庫的對齊結果對齊(Fig S3B；評分96.8)，結合文獻資料比較，確認該化合物為大黃素，是大黃中的化學物質。

Fig S3：(A)ESI負離子模式下大黃素的MS²光譜和可能的片段（黑色）

 

2.1.4 酚酸化合物沒食子酸乙酯鑒定：化合物31的分子式為C9H10O5，從MS²光譜中m/z197.0451（[M-H]^-）處的分子離子峰表示（Fig S4A)。與文獻數(shù)據(jù)和庫對齊(Fig S4B）比對，化合物31為沒食子酸乙酯，是紅景天植物中的一種成分。

Fig S4：(A)ESI負離子模式下沒食子酸乙酯的MS²光譜和可能的片段（黑色）

 

2.1.5 苯丙素類化合物連翹苷鑒定：化合物75的質譜中m/z 579.2079處的峰屬于[M+HCOO]-加合物，而m/z 533.2019處的峰對應于[M-H]^-。在MS²光譜中，特征峰分別為m/z371.1490、356.1250和121.0288。庫對齊（Fig S5B）和與文獻數(shù)據(jù)的比較表明，化合物75是連翹苷，連翹中的一種化學物質�？赡艿钠�段化途徑和特征片段如Fig S5A所示。

Fig S5：(A)連翹苷在ESI負離子模式下的MS²光譜和可能的片段（黑色）

 

2.1.6 酚類化合物紅景天苷鑒定：化合物17的MS²光譜中m/z 299.1133處的峰歸屬于[M-H]^-離子。一些特征峰和相應的片段位于m/z 137.0605（[M-H-Glc]^-）和m/z 119.0496（[M-H-Glc-H2O]^-），數(shù)據(jù)與先前的研究一致�？赡艿牧呀馔緩饺鐖DS6A所示。庫對齊（Fig S6B；得分96.6）將該化合物鑒定為紅景天苷，一種紅景天中的化合物。

Fig S6：(A)ESI正離子模式下紅景天苷的MS²光譜和可能的片段（黑色）

 

2.1.7 生物堿類化合物腺嘌呤鑒定：化合物7的分子式為C5H5N5。MS²光譜中只有兩個特征峰（圖S7A）：m/z 136.0619（[M+H]⁺）和m/z 119.0356（[M+H-NH3]⁺）。與文獻數(shù)據(jù)和庫對齊結果的比較（Fig S7B）表明，化合物7是腺嘌呤，一種板藍根中的生物堿。

Fig S7：(A)ESI正離子模式下腺嘌呤的MS²光譜和可能的片段（黑色）

 

2.1.8 苦杏仁苷鑒定：化合物22具有C20H27NO11的分子式，如m/z 458.1675（[M+H]⁺）和m/z 475.1922（[M+NH4]⁺）處的峰所示。m/z 296.1129處的峰歸因于[M+NH4-Glc]⁺，其他特征片段以及可能的片段化途徑如Fig S8A所示。可能的裂解途徑與參考文獻的比較，以及ESI（-）模式下保留時間的庫對齊（圖S8B）表明，化合物22是苦杏仁苷，是苦杏仁中的化學成分。

Fig S8：(A)ESI正離子模式下苦杏仁苷的MS²光譜和可能的片段（黑色）

 

2.2 GC-MS分析

三種提取物的總離子色譜圖（TICs；Fig S9）相似。在乙酸乙酯中提取的LHQW膠囊的TIC如Fig 2所示。通過將獲得的數(shù)據(jù)與NIST質譜庫和先前報道的文獻中的數(shù)據(jù)進行比較，總共鑒定出17種揮發(fā)性化合物（表2）。結果表明，用峰面積歸一化法計算，主要成分為薄荷醇，相對百分比為97.89%。其他最豐富的成分是廣藿香醇（0.47%）等。這里大多數(shù)成分是從薄荷和廣藿香中提取的萜類化合物。據(jù)Kiyohara等人報道，廣藿香醇具有抗病毒和抗炎活性。

Fig S9：通過用不同溶劑提取的LHQW膠囊的GC-MS分析獲得的總離子色譜圖（TICs，4-25分鐘）的放大圖像。（A） 乙酸乙酯、（B）正己烷、（C）丙酮。

MH：薄荷腦；PH：廣藿香

 

在本研究中，首次使用HPLC-Q Exactive Orbitrap MS結合GC-MS方法來鑒定LHQW膠囊中該化學物質。LHQW是一種用于治療嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合征冠狀病毒2型感染的癥狀的中成藥。此外，發(fā)現(xiàn)MS和MS²光譜庫對齊方法是快速識別復雜混合物成分的一種方便方法。本研究共成功檢測并鑒定了生物堿、黃酮類、酚類、酚酸、苯丙類、醌類、萜類等120種成分。

 

研究結論

 

本研究結果有助于進一步研究LHQW膠囊的活性化學成分及其作用機制，可為LHQW膠囊的質量控制和標準化提供依據(jù)。

 

文章推薦

 

1.這是第一份通過HPLC-Q Exactive Orbitrap MS和GC MS鑒定連花清瘟膠囊中主要化學成分的綜合報告；

2.采用了液質和氣質兩大質譜聯(lián)用技術，結合文獻及庫對齊方式實現(xiàn)對化合物的快速鑒定；

3.中藥復方成分鑒定分析的經(jīng)典案例之一。

 

參考文獻

[1] Z. Yang, Z. Li, Z. Li, DPPH-HPLC-MS assisted rapid identifification of endothelial protective substances froM Xiao-Ke-An, J. Ethnopharmacol. 211 (2018) 188-196.

[2] Z. Yang, J. Zhu, H. Zhang, et al., Investigating cheMical features of Panax notoginseng based on integrating HPLC fifingerprinting and determination of Multiconstituents by single reference standard, J. Ginseng Res. 42 (2018) 334-342.

[3] L. Ory, E.-H. Nazih, S. Daoud, et al., Targeting bioactive compounds in natural extracts - development of a coMprehensive workflflow combining chemical and biological data, Anal. Chim. Acta 1070 (2019) 29-42.

[4] Z. Yang, H. Tang, Q. Shao, et al., Enrichment and purifification of the bioactive flflavonoids from flflower of Abelmoschus Manihot (L.) Medic using Macroporous resins, molecules 23 (2018), 2649.

[5] L.F. Nothias, M. Nothias-Esposito, R. da Silva, et al., Bioactivity-based molecular networking for the discovery of drug leads in natural product bioassay guided fractionation, J. Nat. Prod. 81 (2018) 758-767.

[6] Z.H. Li, X.M. Guo, Z.L. Cao, et al., New MS network analysis pattern for the rapid identifification of constituents from traditional Chinese medicine prescription Lishukang capsules in vitro and in vivo based on UHPLC/Q-TOF-MS, Talanta 189 (2018) 606-621.

[7] H.-Q. Pang, H.-M. An, H. Yang, et al., Comprehensive cheMical profifiling of Yindan Xinnaotong soft capsule and its neuroprotective activity evaluation in vitro, J. ChroMatogr. A 1601 (2019) 288-299.

[8] R.-Z. Liu, R. Wang, H.-M. An, et al., A strategy for screening bioactive components from natural products based on two-dimensional cell Membrane chromatography and coMponent-knockout approach, J. Chromatogr. A 1601 (2019) 171-177.

[9] M. Liao, H. Shang, Y. Li, et al., An integrated approach to uncover quality  marker underlying the effects of Alisma orientale on lipid metabolism, using chemical analysis and network pharmacology, Phytomedicine 45 (2018) 93-104.

[10] P. Rossignol, A.F. Hernandez, S.D. Solomon, et al., Heart failure drug treatment, Lancet 393 (2019) 1034-1044.