水提金銀花多糖通過調(diào)節(jié)NLRP3-IL-17信號軸減輕過敏性鼻炎

文章標(biāo)題：Water-extracted Lonicera japonica polysaccharide attenuates allergic rhinitis by regulating NLRP3-IL-17 signaling axis
發(fā)表期刊：Carbohydrate Polymers
影響因子：10.723
作者單位：遵義醫(yī)科大學(xué)
百趣提供服務(wù)：16S測序

研究背景
流行病學(xué)研究表明，全世界約有5億過敏性鼻炎(Allergic rhinitis, AR)患者，每年呈增長趨勢。AR雖不會危及生命，但是其臨床癥狀引起的情緒問題和間接經(jīng)濟(jì)損害不容忽視。在AR病理學(xué)研究中，發(fā)現(xiàn)Th1/Th2失衡以及異常高的免疫球蛋白E(immunoglobulin E, IgE)和肥大細(xì)胞表達(dá)水平是AR的重要致病因素。NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)炎性小體作為先天免疫的重要組成部分，在機(jī)體的免疫反應(yīng)和疾病發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用。其和IL-1β的過表達(dá)都存在于AR中，IL-1β促進(jìn)Th0向Th17細(xì)胞分化，釋放IL-17和其他相關(guān)細(xì)胞因子，從而促進(jìn)過敏反應(yīng)。而腸道微生物群的不平衡可誘發(fā)過敏反應(yīng)，增加IgE的產(chǎn)生，也最終導(dǎo)致AR。

目前治療AR的臨床藥物只能緩解癥狀，長期使用可能會引起嗜睡等副作用。因此，重要的是開發(fā)更好的AR治療方法，減少不良反應(yīng)。益生元可以調(diào)節(jié)腸道菌群失衡，修復(fù)腸道機(jī)械屏障，改善AR。而多糖除了是益生元外，還具有廣泛的藥理活性，例如抗炎、免疫調(diào)節(jié)等。

本研究以一種新的水提金銀花多糖(Water-extracted Lonicera japonica polysaccharide, WLJP)為研究對象，按每組8只小鼠，分為對照組（給予生理鹽水）、AR組（給予卵清蛋白(ovalbumin, OVA)）、WLJP-L組（30mg/kg WLJP-0.25p）和WLJP-H組（60mg/kg WLJP-0.25p）。除對照組外，其余三組分別在0、3、6、9、12、15天進(jìn)行致敏處理；在21-30天，對WLJP-L組和WLJP-H組進(jìn)行灌胃給藥，對照組及AR組給予生理鹽水。于第31天將小鼠置于觀察籠中，觀察并記錄小鼠在10分鐘內(nèi)的噴嚏和摩擦次數(shù)（圖1A）。隨后，麻醉小鼠，收集鼻粘膜、結(jié)腸組織和眼靜脈叢，以獲得血液和組織樣本。進(jìn)一步進(jìn)行細(xì)胞因子檢測、鼻腔組織的病理學(xué)評價、免疫熒光檢測、流式細(xì)胞術(shù)分析、蛋白質(zhì)印跡法(western blot, WB)分析、16S rDNA測序、分子對接和動力學(xué)模擬，以研究其對AR的免疫調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制。

研究結(jié)果
1.WLJP-025p的提取、分離及化學(xué)性質(zhì)分析
按照蒸餾水提取、乙醇沉淀凍干的流程來制備WLJP（5.1%），高效凝膠滲透色譜分析表明WLJP-025p是一個均勻的多糖組分。然后采用柱前衍生化高效液相色譜測定其糖成分，顯示其為一種具有中性糖側(cè)鏈的富含HG結(jié)構(gòu)域的果膠多糖。最后通過核磁共振實驗得出其主要結(jié)構(gòu)性質(zhì)。

2.WLJP改善OVA誘發(fā)的過敏性鼻炎
在摩擦和打噴嚏評估（圖1B）中，在AR組有顯著增加，而WLJP-L和WLJP-H組顯著改善。AR組的血清IgE水平明顯高于對照組，WLJP治療顯著降低了IgE濃度（圖1C）。在圖1D中，蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin and eosin, H&E)染色顯示AR組的表皮明顯增厚，WLJP治療顯著抑制表皮厚度。在過碘酸-雪夫染色(periodic acid Schiff, PAS)中（圖1E），對照組的鼻粘膜中未發(fā)現(xiàn)杯狀細(xì)胞，而AR組觀察到大量杯狀細(xì)胞，WLJP-H組杯狀細(xì)胞表達(dá)減少。
 

圖1. WLJP改善OVA誘發(fā)的過敏性鼻炎

3.WLJP抑制小鼠鼻粘膜NLRP3炎性小體的激活和OVA誘發(fā)的Th17細(xì)胞的分化
WLJP抑制NLRP3、CASP1表達(dá)和NLRP3炎癥小體激活（圖2A）。WLJP顯著抑制了OVA誘導(dǎo)的鼻粘膜組織中NLRP3炎癥體元件（NLRP3、CASP1、IL-1β）蛋白表達(dá)的上調(diào)（圖2B）。AR組中IL-17紅色和p65綠色染色豐富，且p65主要在細(xì)胞核中表達(dá)，然而WLJP-L和WLJP-H組的IL-17和p65表達(dá)水平顯著降低，只有少量p65在細(xì)胞核中表達(dá)（圖2C）。同時，WLJP在鼻粘膜組織WB檢測中以劑量依賴性方式抑制核p65易位和IL-17表達(dá)（圖2D）。在流式細(xì)胞術(shù)分析中，觀察到AR組的Th17細(xì)胞表達(dá)顯著高于對照組，而WJLP-L和WLJP-H組的Th17-細(xì)胞表達(dá)均降低（圖2E）。AR組血清IL-17（圖2F）和IL-β（圖2G）濃度增加，而WLJP-L和WLJP-H不同程度的抑制IL-17的釋放。
 

圖2. WLJP抑制OVA誘導(dǎo)的相關(guān)炎癥通路作用和Th17細(xì)胞分化

4.WLJP抑制小鼠腸道NLRP3炎癥小體激活并減輕腸道屏障損傷
WLJP抑制結(jié)腸組織中AR誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化（圖3A）和NLRP3過度表達(dá)（圖3B）。H&E染色顯示小鼠結(jié)腸的病理變化如圖3C。結(jié)果顯示，WLJP抑制AR誘導(dǎo)的粘附連接蛋白β-連環(huán)蛋白和E-鈣粘蛋白、緊密連接蛋白ZO1和閉塞蛋白表達(dá)的減少，腸粘膜上皮組織分布減少（圖3D，E）。
 

圖3. WLJP減輕小鼠腸道屏障損傷并抑制腸道NLRP3炎癥小體激活

5.WLJP可減輕OVA誘導(dǎo)的小鼠腸道微生物群的異常變化
進(jìn)一步的腸道微生物分析顯示，每組中同時出現(xiàn)了472個屬（圖4A），OVA和WLJP給藥改變了微生物屬的組成（圖4B）。圖4C是對前50個屬水平細(xì)菌的相關(guān)性分析，其中有9個菌發(fā)生了顯著變化。WLJP顯著抑制AR誘導(dǎo)的小鼠腸道微生物群異常變化（圖4D）。根據(jù)顯著改變的屬的豐度情況（圖4E）和功能預(yù)測的結(jié)果（圖4F），發(fā)現(xiàn)與炎癥和免疫功能相關(guān)的基因比例發(fā)生了變化，表明腸道微生物與AR的發(fā)病機(jī)制以及WLPJ的改善有關(guān)。
 

圖4. WLJP可減輕OVA誘導(dǎo)的小鼠腸道微生物群的異常變化

6.分子對接和動力學(xué)模擬
通過模擬WLJP-025p的水解片段和NLRP3的可能作用模式（圖5A），發(fā)現(xiàn)可能的結(jié)合位點(diǎn)如圖5B所示。對�？繕�(gòu)象進(jìn)行了50ns分子動力學(xué)模擬。首先分析了蛋白質(zhì)-小分子配合物在分子動力學(xué)軌跡上的均方根偏差(Root Mean Square Deviation, RMSD)，如圖所示，持續(xù)10ns后，4個RMSD處于穩(wěn)態(tài)，對10-50ns的軌跡進(jìn)行采樣和分析。其中5個GalA單體穩(wěn)定結(jié)合在蛋白腔內(nèi)，另外5個穩(wěn)定結(jié)合在蛋白表面的凹槽內(nèi)(圖5C)。同時發(fā)現(xiàn)結(jié)合小分子的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)整體是穩(wěn)定的。大多數(shù)氨基酸的均方根波動(Root Mean Square Fluctuation, RMSF)在0.2nm以下，其中>0.2氨基酸位于C端和N端，即環(huán)區(qū)(圖5D)。最后，發(fā)現(xiàn)小分子和蛋白質(zhì)形成的氫鍵數(shù)約為10個(圖5E)。
 

圖5. 分子對接和動力學(xué)模擬
 

WLJP靶向NLRP3抑制巨噬細(xì)胞炎癥
(12-)豆蔻酸佛波酯(-13-)乙酸鹽(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)，誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞成為巨噬細(xì)胞，聯(lián)合NLRP3抑制劑研究WLJP的作用機(jī)制。圖6A所示，WLJP和NLRP3抑制劑CY-09均不影響巨噬細(xì)胞的存活能力。在ELISA TNF-α（圖6B）和IL-1β檢測（圖6C）中，發(fā)現(xiàn)WLJP和CY09均能抑制LPS+IFN-γ引起的炎癥反應(yīng)。隨后對CY-09和WLJP組進(jìn)行的交互分析，表明這兩個因素對LPS+IFN-γ組的因變量TNF-α和IL-1β有顯著的交互作用。巨噬細(xì)胞免疫熒光染色顯示，WLJP和CY-09抑制NLRP3炎癥小體活化（圖6D）。在巨噬細(xì)胞WB分析中，觀察到WLJP顯著抑制NLRP3炎癥小體活化和炎癥表達(dá)，與鼻粘膜WB分析結(jié)果一致（圖6E）。在NLRP3抑制劑CY-09中也觀察到了同樣的現(xiàn)象。同樣，CY-09和WLJP組的相互作用分析顯示了顯著的相互作用。
 

圖6. WLJP靶向NLRP3抑制巨噬細(xì)胞炎癥 結(jié)論

金銀花的一種新型金銀花多糖“WLJP”可能通過修復(fù)受損的腸道屏障、調(diào)控炎癥免疫交互對話來改善AR。