條件性敲除Ep3的Ep3F/F小鼠在揭示急性腎損傷發(fā)病機制中的應用

急性腎損傷（acute kidney injury, AKI）是一種由導致腎臟結構或功能變化的損傷引起的腎功能短時間內急劇下降的臨床綜合征，其發(fā)病機制復雜，具有高發(fā)病率和高死亡率。缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury, IRI）是誘導AKI的主要原因之一。調節(jié)性細胞死亡（regulate cell death, RCD），包括凋亡（apoptosis）和調節(jié)性壞死（regulate necrosis, RN），在AKI中的作用十分關鍵。PGE2/E-前列腺素受體亞型3（EP3）信號通路可以通過EP3/Gi/Ca2+信號通路介導急性炎癥反應。然而，EP3缺失是否影響AKI，以及如何與RCD相互作用的機制仍不清楚。

近日，汕頭大學劉斌及周應畢共同通訊在Kidney International（IF=19）在線發(fā)表題為“E-prostanoid 3 receptor deficiency on myeloid cells protects against ischemic acute kidney injury via breaking the auto-amplification loop of necroinflammation”的研究論文，該研究表明，髓系細胞EP3缺失通過打破壞死性炎癥的自我放大環(huán)路減輕缺血性AKI，提出阻斷EP3受體可能成為治療AKI及有類似發(fā)病機制疾病的新策略。
 

圖片來源：《Kidney International》

研究材料與方法
在這項研究中，研究人員使用了C57BL/6野生型小鼠和同遺傳背景的Ep3^-/-小鼠，委托賽業(yè)生物構建的條件性敲除Ep3的Ep3^F/F小鼠，隨后通過與Lyz2^Cre配繁獲得髓系細胞中的Ep3特異性敲除鼠。作者采用切除一側腎臟，另一側單腎缺血30min，再灌注24h的手術模型，并通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清肌酐和尿素氮、HE染色法評估腎損傷，同時開展了一系列實驗深入研究其機制，以確定髓系細胞中的EP3受體的重要作用。

技術路線

研究結果
1.阻斷EP3受體通過打破壞死性炎癥的自我放大環(huán)路減輕IR誘導的AKI
缺血再灌注(Ischemia reperfusion, IR)誘導的AKI模型中，PGE₂、PGI₂（均可激活EP3受體）生成水平及其合成相關的蛋白表達上調，阻斷EP3受體可以顯著減輕IR誘導的AKI。同時，通過ELISA和免疫熒光等方法檢測此過程的炎癥反應，EP3缺失后，IR誘導的炎癥反應明顯受到抑制。
 

前列腺素類產物PGE2、PGI2水平及及其合成相關的蛋白表達上調^[1]
 

阻斷EP3受體可以減輕IR誘導的AKI，減少炎癥反應^[1]

細胞死亡在AKI中扮演重要角色。研究結果表明，壞死性凋亡和細胞凋亡參與此研究實驗模型，EP3缺失減輕了腎臟IR后的壞死性凋亡水平，但不影響整體的凋亡水平。

值得注意的是，EP3缺失抑制了IR誘導的JAK2/STAT3信號通路的激活，并進一步上調了IR后caspase-8的表達，同時減輕了IR誘導的內源性細胞凋亡。提示EP3缺失至少通過部分是通過抑制JAK2/STAT3信號通路，上調了腎臟IR后caspase-8的表達，將會引發(fā)炎癥的壞死性凋亡轉換成了相對溫和、不會引起炎癥的細胞凋亡，從而達到保護作用。
 

EP3缺失至少部分通過抑制JAK2/STAT3信號通路，上調腎臟IR后caspase-8的表達，將壞死性凋亡轉換為凋亡，從而達到保護作用^[1]

通過檢測相應的標志物，確認在該研究的模型中，其他形式的RN幾乎不參與介導壞死性炎癥的發(fā)生發(fā)展。
 

鐵死亡、焦亡、自噬幾乎不參與本研究IR模型中壞死性炎癥的發(fā)生發(fā)展^[1]
 

線粒體通透性轉換調節(jié)的細胞死亡以凋亡的形式參與此模型中IR誘導的AKI[1]

通過藥物分別干預壞死和炎癥，確認在此模型中存在壞死和炎癥形成自我放大環(huán)路，EP3缺失可以通過抑制炎癥，從而減少壞死，打破了壞死性炎癥的自我放大環(huán)路，實現(xiàn)保護作用。

壞死性凋亡（Nec-1、GSK872）被抑制的情況下，EP3缺失沒有進一步減輕AKI和炎癥^[1]
 

EP3缺失的情況下，阻斷TLR4（TAK-242）沒有進一步減輕炎癥、減少AKI和DAMPs的釋放^[1]

2.髓系細胞EP3缺失在改善IR誘導的AKI中起主導作用
為了探究在EP3受體在IR誘導的AKI中，不同細胞類型的作用效果，通過骨髓移植技術建立骨髓移植嵌合體小鼠，分別建立實質細胞/骨髓源性細胞中特異性缺失EP3的小鼠（Ep3KO^BM-WT/WT^BM-Ep3KO），或者骨髓源性、實質細胞中均缺失/均不缺失EP3的小鼠（Ep3KO^BM-Ep3KO/WT^BM-WT）。同時利用賽業(yè)生物構建的Ep3^F/F小鼠配繁后得到髓系細胞條件性敲除Ep3的小鼠（Ep3^F/F;Lyz^2Cre），建立缺血再灌注手術模型。結果顯示，骨髓源性細胞EP3缺失的小鼠（WT^BM-Ep3KO）保護作用強于實質細胞EP3缺失的小鼠（Ep3KO^BM-WT），且保護作用與骨髓源性細胞和實質細胞中均缺失EP3的小鼠（Ep3KO^BM-Ep3KO）無差異，已經達到最佳保護效果。髓系細胞中條件性敲除Ep3基因的小鼠（Ep3^F/F；Lyz2^Cre）同樣有保護作用，且保護效果與全身性Ep3基因敲除小鼠（Ep3^-/-）一致，提示，阻斷EP3可以減輕由IR誘導的AKI，其髓系細胞中的EP3起主導作用。
 

髓系細胞EP3缺失在減輕IR誘導的AKI中起主導作用^[1]

研究結論

阻斷EP3受體可以減輕小鼠腎臟IR誘導的AKI，且髓系細胞中的EP3在此作用中起關鍵作用^[1]

總的來說，該研究表明，阻斷EP3受體可以減輕小鼠腎臟IR誘導的AKI，且髓系細胞中的EP3在此作用中起關鍵作用。髓系細胞EP3缺失可以抑制炎癥，并具體通過以下兩條途徑影響壞死性凋亡：一方面通過減少TNF-α等炎癥因子的生成而減輕壞死性凋亡，另一方面，至少部分通過抑制IL-6/JAK2/STAT3以上調caspase-8，將細胞的死亡模式從壞死性凋亡轉換為相對溫和的細胞凋亡來實現(xiàn)的。因此，EP3可能是預防和治療包括AKI在內的具有類似機制的炎癥相關疾病的潛在作用靶點。

原文檢索：
[1] Leng J, Zhao W, Guo J, Yu G, Zhu G, Ge J, He D, Xu Y, Chen X, Zhou Y, Liu B. E-prostanoid 3 receptor deficiency on myeloid cells protects against ischemic acute kidney injury via breaking the auto-amplification loop of necroinflammation. Kidney Int. 2022 Sep 8:S0085-2538(22)00695-0. doi: 10.1016/j.kint.2022.08.019. Epub ahead of print. PMID: 36087809.
 

Ptger3 KO小鼠
（Ep3 KO小鼠）

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：
C57BL/6J-Ptger3^em1C/Cya

品系編號：
KOCMP-19218-Ptger3-B6J-VA

產品編號：
S-KO-03863

應用方向：
發(fā)育生物學,免疫系統(tǒng),心血管系統(tǒng),神經系統(tǒng),蛋白質代謝,腎和泌尿系統(tǒng),生分子生物學

打靶方案：

Ptger3 flox小鼠
（Ep3 flox小鼠）

小鼠福利，限定發(fā)放中~

品系名稱：
C57BL/6N-Ptger3^em1Cflox/Cya

品系編號：
CKOCMP-19218-Ptger3-B6N-VA

產品編號：
S-CKO-04534

應用方向：
發(fā)育生物學,免疫系統(tǒng),心血管系統(tǒng),神經系統(tǒng),蛋白質代謝,腎和泌尿系統(tǒng),生分子生物學

打靶方案：