NEPA21—利用黃熱病病毒復(fù)制子構(gòu)建SARS-CoV-2 repRNA疫苗及其檢測

利用黃熱病病毒復(fù)制子構(gòu)建SARS-CoV-2 repRNA疫苗及其檢測

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)感染引起的2019冠狀病毒病(COVID-19)大流行是一種全球性威脅。SARS-CoV-2的主要傳播途徑包括咳嗽、打噴嚏和呼吸道飛沫以及氣溶膠等。癥狀輕的患者可在10天后康復(fù)，而嚴(yán)重者因肺泡損傷而出現(xiàn)間歇性呼吸衰竭導(dǎo)致死亡，因此為了預(yù)防大流行，開發(fā)安全有效的疫苗是極有必要的。

2022年，日本科學(xué)家在國際知名科學(xué)期刊PLOS ONE上發(fā)表了題為“Construction and evaluation of a selfreplicative RNA vaccine against SARS-CoV-2 using yellow fever virus replicon”的文章，該研究將編碼SARS-CoV-2刺突(S)蛋白的基因插入到黃熱病病(YFV)毒株復(fù)制子中，構(gòu)建并檢測了一種repRNA疫苗，復(fù)制子RNA (repRNA)是一種安全、有效的疫苗，該疫苗不僅編碼抗原基因，還編碼RNA復(fù)制所需的基因并且自我復(fù)制，因此可以引起強(qiáng)大的免疫力。
 

在本研究中，作者在YFV復(fù)制子中構(gòu)建了含有SARS-CoV-2 （S）蛋白編碼區(qū)的repRNA疫苗（圖1A），同時(shí)也構(gòu)建了non-repRNA疫苗（圖1B）。
 

采用NEPA21電穿孔器(Nepagene)將repRNA和non-repRNA疫苗電穿孔至幼鼠腎細(xì)胞(BHK)。轉(zhuǎn)染后48 小時(shí)，通過western blotting法證實(shí)S蛋白在BHK細(xì)胞中的表達(dá)，同時(shí)免疫熒光法證實(shí)S蛋白與YFV蛋白共表達(dá)。作者采用了Real-time RT-PCR驗(yàn)證repRNA疫苗在BHK細(xì)胞中的自我復(fù)制能力。然后對6周齡雌性C57BL/6小鼠分別于第0、28、56天經(jīng)腹腔注射repRNA疫苗、non-repRNA疫苗各1μg，同時(shí)利用NEPA21電穿孔器向小鼠大腿處提供電脈沖，增強(qiáng)RNA疫苗的遞送。然后通過ELISA法檢測了sars - cov - 2s的igg抗體以及YFV非結(jié)構(gòu)蛋白1 (NS1)抗體水平。此外，作者制備了S蛋白假型熒光素酶報(bào)告慢病毒作為評價(jià)小鼠體液免疫的工具，為了驗(yàn)證YFV復(fù)制子骨干系統(tǒng)和體內(nèi)RNA電穿孔免疫的充分性，構(gòu)建了DENV含有包膜(E)基因的YFV復(fù)制子，并采用與SARS-CoV-2 repRNA疫苗基本相同的方法進(jìn)行了評估。第三次接種后20天，從小鼠身上分離脾臟淋巴細(xì)胞。利用這些脾細(xì)胞，采用單色酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)法(IMMUNOSPOT)進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附斑點(diǎn)(ELISpot)檢測。
 

通過上述一系列實(shí)驗(yàn)，成功生成了一種編碼repRNA疫苗的DNA質(zhì)粒，該質(zhì)粒在YFV復(fù)制子中含有S蛋白的外結(jié)構(gòu)域（圖1A）。western blotting法證實(shí)了repRNA和non-repRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)S蛋白(圖2A)，但repRNA表達(dá)的S蛋白明顯高于non-repRNA, non-repRNA幾乎檢測不到S蛋白(圖2B)。此外，利用實(shí)時(shí)RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞中RNA水平的動(dòng)力學(xué)，以探究repRNA疫苗的自我復(fù)制能力。在轉(zhuǎn)染后24-96小時(shí)，與未轉(zhuǎn)染repRNA疫苗的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染repRNA疫苗的細(xì)胞中RNA水平顯著升高(圖2D)。這些數(shù)據(jù)表明，repRNA疫苗構(gòu)建成功且具有自我復(fù)制能力，證明了其疫苗效力。
 

圖1、repRNA與non-repRNA疫苗的構(gòu)建

圖2、repRNA和non-repRNA疫苗的體外檢測
 

為了進(jìn)一步研究細(xì)胞免疫的誘導(dǎo)作用，在第三次免疫后20天采集接種SARS-CoV-2小鼠的脾細(xì)胞，并進(jìn)行ELISpot檢測。在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭�，repRNA疫苗的免疫水平雖然有限，但與non-repRNA疫苗相比，它在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)了t細(xì)胞應(yīng)答(圖3)。
 

圖3、repRNA和non-repRNA疫苗的體內(nèi)檢測

本實(shí)驗(yàn)中，研究人員借助NEPA21電轉(zhuǎn)染儀卓越的基因?qū)�入功能完成了RNA疫苗導(dǎo)入到小鼠的腎細(xì)胞中，以及對小鼠進(jìn)行腿部肌肉電轉(zhuǎn)提高RNA疫苗的轉(zhuǎn)染效果，為實(shí)驗(yàn)成功錦上添花。該研究證實(shí)所制備的repRNA疫苗能夠在體外表達(dá)S蛋白并具有自我復(fù)制能力。該疫苗在小鼠體內(nèi)并沒有強(qiáng)有力地誘導(dǎo)體液免疫，可能是由于S蛋白表達(dá)較低，盡管如此，還是有對S蛋白產(chǎn)生特異性t細(xì)胞反應(yīng)的傾向。同時(shí)在誘導(dǎo)t細(xì)胞活化程度方面，repRNA疫苗顯著高于non-repRNA疫苗，證實(shí)了repRNA作為疫苗的有效性。然而，為了提高repRNA疫苗的免疫誘導(dǎo)能力，后續(xù)還需要進(jìn)一步優(yōu)化疫苗給藥方式，提高S蛋白的表達(dá)。
 

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計(jì)的電轉(zhuǎn)程序，配合專利的電壓衰減設(shè)計(jì)，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，提高細(xì)胞存活率。操作簡單，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見可調(diào)，適用性強(qiáng)。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、活體動(dòng)物、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染，多篇文獻(xiàn)支持，是Crisper/Cas-9基因編輯的主流品牌電轉(zhuǎn)系統(tǒng)！
 

文獻(xiàn)信息

（1）原文鏈接：

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0274829

（2）參考文獻(xiàn)：

1、Nakamura A, Kotaki T, Nagai Y, Takazawa S, Tokunaga K, et al. (2022) Construction and evaluation of a self-replicative RNA vaccine against SARS-CoV-2 using yellow fever virus replicon. PLOS ONE 17(10): e0274829.

2、Li P, Luo Z, Liu P, Gao N, Zhang Y, Pan H, et al. Bioreducible alginate-poly(ethylenimine) nanogels as an antigen-delivery system robustly enhance vaccine-elicited humoral and cellular immune responses. J Control Release. 2013; 168: 271–279.

3、Erasmus JH, Khandhar AP, O’Connor MA, Walls AC, Hemann EA, Murapa P, et al. An Alphavirus derived replicon RNA vaccine induces SARS-CoV-2 neutralizing antibody and T cell responses in mice and nonhuman primates. Sci Transl Med. 2020; 12: 9396.

4、Long B, Carius BM, Chavez S, Liang SY, Brady WJ, Koyfman A, et al. Clinical update on COVID-19 for the emergency clinician: Presentation and evaluation. Am J Emerg Med. 2022; 54:46–57.

5、百度百科

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