iTRAQ/TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組的應(yīng)用為探究OA治療提供新方向

文章標(biāo)題：Metabolite asymmetric dimethylarginine (ADMA) functions as a destabilization enhancer of SOX9 mediated by DDAH1 in osteoarthriti
發(fā)表期刊：Science Advances
影響因子：14.95
作者單位：浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院

百趣提供服務(wù)：iTRAQ/TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組

研究背景
骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)是一種退行性疾病，伴有一系列代謝變化和酶的改變。本研究報(bào)道了二甲基精氨酸二甲氨基水解酶-1(dimethylarginine dimethylaminohydrolase-1, DDAH1)的下調(diào)伴隨著變性軟骨細(xì)胞和OA樣本中不對(duì)稱二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine, ADMA)的增加。整體或條件性敲除軟骨細(xì)胞的ADMA水解酶DDAH1加速了小鼠OA的發(fā)展。ADMA誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞變性和衰老，減少細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而加速OA的進(jìn)展。ADMA同時(shí)與SOX9及其去泛素化酶USP7結(jié)合，阻斷USP7對(duì)SOX9的去泛素化作用，從而導(dǎo)致SOX9降解。OA患者滑液中ADMA水平升高，對(duì)OA診斷具有良好的敏感性和特異性的預(yù)測價(jià)值。因此，激活DDAH1以降低ADMA水平可能是OA治療的潛在治療策略。

技術(shù)路線

研究結(jié)果
01 骨性關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中ADMA升高會(huì)引發(fā)軟骨變性
針對(duì)6名OA患者和6名相對(duì)健康的患者（膝關(guān)節(jié)骨折，無OA病史）開展代謝組學(xué)分析，兩組出現(xiàn)一系列的代謝物差異。在上調(diào)TOP25的代謝物中，ADMA具有最高的統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，其異構(gòu)體對(duì)稱二甲基精氨酸(Symmetric dimethylarginine, SDMA)沒有實(shí)質(zhì)性變化（圖1 B）。為了研究ADMA是否能在體內(nèi)誘導(dǎo)OA，作者在內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)(destabilization of the medial Meniscus, DMM)手術(shù)1周后將ADMA直接注射到小鼠膝關(guān)節(jié)。ADMA在DMM手術(shù)中顯著加速軟骨退變，促進(jìn)骨贅形成。此外，免疫組織化學(xué)染色證實(shí)，暴露于ADMA的軟骨中II型膠原和聚集蛋白的表達(dá)降低。熱板分析、旋轉(zhuǎn)桿實(shí)驗(yàn)和野外實(shí)驗(yàn)顯示，注射ADMA的小鼠疼痛閾值和移動(dòng)能力明顯降低�？傊�，這些數(shù)據(jù)表明，退化軟骨細(xì)胞中ADMA的增加會(huì)引發(fā)軟骨變性和衰老。

02DDAH1下調(diào)導(dǎo)致OA患者ADMA升高
ADMA是在精氨酸與甲基化殘基的蛋白分解過程中釋放出來的，隨后被DDAH家族或AGXT2水解。作者使用DDAH1抑制劑PD 404182來探究DDAH1在OA中的作用。結(jié)果顯示ADMA在PD 404182處理的軟骨細(xì)胞中急劇升高（圖1 C）。此外，ADMA在DDAH1−/−（DDAH1全基因敲除小鼠）原代軟骨細(xì)胞中升高（圖1 D）。這些數(shù)據(jù)表明，DDAH1在OA進(jìn)展中受到抑制，從而增加了軟骨細(xì)胞中的ADMA水平。此外，Western blotting和免疫組織化學(xué)驗(yàn)證了DDAH1的缺失（圖1 H）。微團(tuán)培養(yǎng)和3D瓊脂糖培養(yǎng)顯示，DDAH1−/−原代軟骨細(xì)胞中ECM沉積較低（圖1 E、F）。雖然在20周齡的DDAH1 - / -小鼠中沒有觀察到明顯的OA相關(guān)表型，但DDAH1缺失明顯加速了DMM誘導(dǎo)的OA小鼠的軟骨退變（圖1 G）。免疫組織化學(xué)顯示，DDAH1 - / -小鼠軟骨中的II型膠原和聚集蛋白減少（圖1 H），可以確定ADMA在DDAH1的作用下可以快速水解。
 

圖1. DDAH1上調(diào)ADMA加速OA進(jìn)

03軟骨特異性DDAH1參與骨關(guān)節(jié)炎進(jìn)展
為了進(jìn)一步研究DDAH1的作用，作者建立DDAH1fl/fl（DDAH1條件敲除小鼠）小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在軟骨細(xì)胞中ADMA表現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)。RT-PCR結(jié)果顯示合成代謝因子（COL2A1和ACAN）降低，分解代謝因子（MMP3和MMP13）升高（圖2 A）；此外，DDAH1缺失后，aggrecan和COL2A1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（圖2 B）。為了排除DDAH1對(duì)骨骼的影響，作者使用Col2-CreERT2和ACAN-CreERT2小鼠產(chǎn)生DDAH1條件敲除小鼠，使軟骨細(xì)胞中DDAH1基因條件缺失。與對(duì)照組相比，軟骨中DDAH1的缺失會(huì)導(dǎo)致DMM手術(shù)后更嚴(yán)重的軟骨損傷（圖2 C）。此外，DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2小鼠軟骨中II型膠原蛋白和聚集蛋白的表達(dá)明顯降低（圖2 D）。

同時(shí)，在DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACAN-CreERT2小鼠中觀察到更多的骨贅（圖2 E）。作者也對(duì)軟骨下骨密度進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACANCreERT2小鼠均表現(xiàn)出更高的軟骨下骨體積（圖2 F）。熱板、旋轉(zhuǎn)桿和野外實(shí)驗(yàn)表明，DDAH1fl/fl、Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl、ACAN-CreERT2小鼠對(duì)疼痛更敏感，并有一定程度的運(yùn)動(dòng)障礙（圖2 G）。LC-MS證實(shí)了DDAH1過表達(dá)的軟骨細(xì)胞中ADMA水平降低。說明DDAH1可部分逆轉(zhuǎn)DMM誘導(dǎo)的小鼠骨性關(guān)節(jié)炎。
 

圖2. 特異性敲除DDAH1加速OA發(fā)展

04ADMA激活SOX9的泛素-蛋白體途徑
ADMA作為一種內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物，可以通過NO影響病理生理過程，通過實(shí)驗(yàn)證明ADMA誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞退變不依賴于NOS/NO途徑。為了更好地了解ADMA誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞變性機(jī)制，作者對(duì)ADMA處理的細(xì)胞進(jìn)行了TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究（上海百趣生物提供）。KEGG分析揭示了幾種豐富的OA相關(guān)通路，如ECM受體相互作用、TNF信號(hào)通路、細(xì)胞衰老和糖胺聚糖生物合成（圖3 A）。

火山圖顯示，分解代謝因子（MMP3和MMP13）、衰老標(biāo)志物(P21)和炎癥趨化因子（CCL2、CCL5和CXCL10）上調(diào)，合成代謝因子（aggrecan、COL2A1和SOX9）下調(diào)（圖3 B)。先前的一項(xiàng)研究表明，SOX9缺乏導(dǎo)致健康軟骨蛋白聚糖丟失，并導(dǎo)致創(chuàng)傷性O(shè)A后嚴(yán)重的軟骨侵蝕。作者接下來重點(diǎn)關(guān)注SOX9是否是ADMA影響的核心蛋白。RT-PCR顯示，DDAH1的缺失沒有顯著改變SOX9 RNA水平（圖3 C）。然而，暴露于ADMA或DDAH1缺失的軟骨細(xì)胞中，SOX9蛋白表達(dá)顯著下調(diào)（圖3 D和3 E）。

此外，免疫組織化學(xué)表明，關(guān)節(jié)注射PD 404182的小鼠（圖3 F）或DDAH1fl/fl, Col2-CreERT2和DDAH1fl/fl, ACAN-CreERT2小鼠的軟骨中SOX9的表達(dá)急劇下降（圖3 G、 H）。此外，暴露于ADMA的細(xì)胞中SOX9的半衰期比對(duì)照細(xì)胞短，表明ADMA導(dǎo)致SOX9的不穩(wěn)定性。MG132（一種蛋白酶體抑制劑）處理阻斷了SOX9的降解，而氯喹（一種溶酶體抑制劑）則沒有，這表明SOX9的降解依賴于蛋白酶體而不是溶酶體途徑（圖3 I、J）。此外，ADMA誘導(dǎo)的SOX9降解在過表達(dá)DDAH1的軟骨細(xì)胞中部分逆轉(zhuǎn)（圖3 K）。值得注意的是，ADMA增加了泛素化SOX9的水平（圖3 L）�？傊�，ADMA通過泛素-蛋白酶體途徑觸發(fā)SOX9降解。
 

圖3. ADMA通過泛素-蛋白酶體途徑誘導(dǎo)SOX9降解

05ADMA阻斷SOX9和USP7之間的相互作用
在證明ADMA通過泛素-蛋白酶體途徑加速SOX9降解后，作者下一步的目標(biāo)是確定ADMA如何影響SOX9水平。作者合成了生物素-ADMA，將其與軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，質(zhì)譜檢測，結(jié)合UbiBrowser數(shù)據(jù)庫，預(yù)測了SOX9相關(guān)E3泛素連接酶或去泛素化酶(Deubiqui-tinating enzymes, DUBs)特異性相互作用的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)DUB USP7可能參與其中（圖4 A、B）。免疫沉淀結(jié)果顯示USP7能夠降低泛素化的SOX9。通過Western blotting驗(yàn)證了USP7和ADMA之間的相互作用。質(zhì)譜結(jié)果顯示ADMA與SOX9相互作用，Western blotting進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)。

那么，進(jìn)一步探討ADMA是否與這兩種蛋白質(zhì)直接結(jié)合，系列分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ADMA能夠與SOX9和USP7之間的相互作用區(qū)域結(jié)合，主要是阻止它們的結(jié)合。免疫共沉淀證實(shí)了SOX9和USP7之間的相互作用，而ADMA可以削弱這種相互作用（圖4  C~J）。為了證實(shí)猜想準(zhǔn)確性，抑制USP7后，ADMA不影響SOX9的表達(dá)和對(duì)SOX9的泛素化。這些結(jié)果證實(shí)了ADMA阻斷USP7對(duì)SOX9去泛素化作用。

圖4. ADMA阻斷SOX9和USP7之間的相互作用

06滑液中的ADMA是一種潛在的OA診斷標(biāo)志物
為了研究ADMA在人類滑膜液中是否增加，作者進(jìn)行了回顧性研究（圖5 A）。根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，納入350例OA患者(n = 114 in center1, n = 112 in center 2, and n = 124 in center 3)，并根據(jù)Kellgren-Lawrence (KL)分級(jí)分為輕度、中度和重度3個(gè)階段（圖5 B）�？紤]到OA是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，三個(gè)階段的患者在性別、身高、體重和身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)方面沒有明顯差異，但年齡略有差異（圖5 C）。

和預(yù)期一樣，與相對(duì)健康的患者相比，OA患者滑液中表現(xiàn)為主要ADMA增加，而SDMA沒有表現(xiàn)出臨床意義。嚴(yán)重OA患者滑液中ADMA水平明顯高于中度OA患者（圖5 D），表明ADMA可能與OA進(jìn)展呈正相關(guān)。根據(jù)Pearson相關(guān)分析，滑液中的ADMA與膝關(guān)節(jié)社會(huì)評(píng)分（膝關(guān)節(jié)OA的臨床評(píng)估評(píng)分）（圖5 E）和最小內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)間隙寬度(x線測量關(guān)節(jié)間隙狹窄和評(píng)估OA的關(guān)鍵指標(biāo))呈負(fù)相關(guān)（圖5 F）。此外，ADMA與年齡有輕微的正相關(guān)，與BMI無關(guān)（圖5 G、H）。受試者工作特征(ROC)曲線顯示，滑液ADMA能將OA患者與相對(duì)健康的患者區(qū)分開來，有利于OA的早期診斷，具有良好的敏感性和特異性；但是，不能鑒別晚期OA和早期OA（圖5 I）。這些數(shù)據(jù)表明，滑液中的ADMA可能是OA診斷的潛在標(biāo)志物。
 

圖5. ADMA在人類滑膜液中的變化結(jié)果

總結(jié)
本文中，研究團(tuán)隊(duì)在退化的軟骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了新的生物標(biāo)志物ADMA，ADMA的增加伴隨著DDAH1的下調(diào)。在DDAH1的調(diào)節(jié)下，ADMA促進(jìn)軟骨細(xì)胞和軟骨的退變與衰老，從而加速OA的進(jìn)展，而不依賴于NOS/NO途徑。相反，ADMA直接結(jié)合SOX9和USP7并阻斷它們的相互作用區(qū)域，通過泛素-蛋白酶體途徑促進(jìn)SOX9降解。因此，靶向DDAH1可能為OA治療提供新的方向。