小鼠正常肝細(xì)胞的背景與應(yīng)用及處理方法

 
一、背景
 
小鼠正常肝細(xì)胞是從對(duì)人TGFα進(jìn)行轉(zhuǎn)基因的小鼠（CD1株，MT42系）的肝細(xì)胞中建立的貼壁上皮樣細(xì)胞。
 
通過電子顯微鏡，這些細(xì)胞表現(xiàn)出典型的肝細(xì)胞特征，例如過氧化物酶體和膽小管樣結(jié)構(gòu)。AML12細(xì)胞保留表達(dá)血清（白蛋白，α1抗胰蛋白酶和轉(zhuǎn)鐵蛋白）和間隙連接（連接蛋白26和32）蛋白的高水平mRNA的能力，并且僅包含乳酸脫氫酶的同工酶5。細(xì)胞表達(dá)高水平的人TGFα和較低水平的小鼠TGFα。肝特異性蛋白的表達(dá)隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而降低，但會(huì)通過在無血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)細(xì)胞而重新激活。
 
 
肝臟是由肝細(xì)胞組成，肝細(xì)胞極小，肉眼看不到，必須通過顯微鏡才能看到。每個(gè)肝細(xì)胞表面可分為竇狀隙面、肝細(xì)胞面和膽小管面三種。肝細(xì)胞里面含有許許多多復(fù)雜的細(xì)微結(jié)構(gòu)：如肝細(xì)胞核、肝細(xì)胞質(zhì)、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體、高爾基氏體、微粒體及飲液泡等組成。
 
二、細(xì)胞處理方法
 
1、棄去培養(yǎng)液，加少量消化液潤(rùn)洗一次。
 
2、棄去液體，再加入適量的消化液，25cm2細(xì)胞瓶可加入1-1.5ml消化液，75 cm2細(xì)胞瓶可加入3ml消化液。
 
3、置室溫或37℃放置至細(xì)胞變圓或細(xì)胞分散為單個(gè)細(xì)胞，不要搖動(dòng)以免細(xì)胞成團(tuán)。
 
4、加入新鮮培養(yǎng)液，吹打混勻并加置新瓶中。
 
三、應(yīng)用
 
用于納米化誘癌劑誘發(fā)小鼠肝癌的機(jī)制研究：
 
建立了小鼠肝癌模型,并對(duì)其致癌機(jī)制進(jìn)行了初步研究。目的:制備穩(wěn)定、高效的納米化誘癌劑-nanoDEN,通過長(zhǎng)期、低頻經(jīng)口給予納米化誘癌劑建立良好、快捷、穩(wěn)定的小鼠肝癌模型,研究其致癌機(jī)制。
 
方法：
 
1、采用高壓均質(zhì)法制備納米化誘癌劑-nanoDEN,利用激光粒徑儀測(cè)定其粒徑、zeta電位及穩(wěn)定性,采用掃描電鏡觀察其微觀形態(tài),通過透析袋法測(cè)定納米化誘癌劑的體外釋放,完成納米化誘癌劑的制備與表征。
 
2、在體的動(dòng)物水平方面,經(jīng)口給予16.5 mg/kg納米化誘癌劑等誘發(fā)小鼠肝癌,通過記錄小鼠體重變化、觀察肝臟大體觀（是否出現(xiàn)腫瘤結(jié)節(jié)）、檢測(cè)肝功能生化指標(biāo)（包括ALT、AST等）和鏡下對(duì)肝臟組織染色（H&E及Masson）進(jìn)行評(píng)分,比較納米化誘癌劑與DEN致癌效果。
 
3、分子水平方面,利用免疫組織染色法檢測(cè)β-catenin（腫瘤發(fā)生過程中關(guān)鍵因子）、COX-2（炎癥相關(guān)因子）、PCNA（與腫瘤發(fā)展密切相關(guān)的蛋白）的表達(dá)量變化情況及TUNEL染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的變化,分析納米化誘癌劑的致癌作用。
 
4、離體的細(xì)胞水平方面,采用MTT法檢測(cè)納米化誘癌劑及DEN對(duì)肝癌細(xì)胞株HepG-2、正常肝細(xì)胞株L02的毒性作用,比較納米化誘癌劑與DEN的致癌能力。通過nanoRhod B處理HepG-2及L02細(xì)胞,模擬肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞對(duì)納米化誘癌劑的胞吞作用過程。
 
5、通過小鼠尾靜脈注入nanoRhod B實(shí)驗(yàn),模擬納米化誘癌劑的體內(nèi)分布情況。