非靶代謝組學(xué)及腸道菌群測序在改善乳腺癌相關(guān)性疲勞研究中的應(yīng)用
文章標(biāo)題：Acupuncture ameliorates breast cancer-related fatigue by regulating the gut microbiota-gut-brain axis
發(fā)表期刊：Frontiers in Endocrinology
影響因子：6.055
作者單位：河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院
百趣生物提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)Classic-親水版+腸道菌群測序
研究背景
癌癥相關(guān)疲勞（CRF）是癌癥治療后最常見的不良反應(yīng)。CRF在乳腺癌（BC）存活者中比其他癌癥存活者更為常見。研究發(fā)現(xiàn)，接受化療治療的患者CRF發(fā)生率為70%-100%，且患者的疲勞程度明顯比未接受化療的患者嚴(yán)重�；熆梢酝ㄟ^破壞生理屏障的通透性來激活外周促炎細(xì)胞因子并引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，而生理屏障的滲透性反過來又會導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能障礙，最終導(dǎo)致CRF。而緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白（occludin）和緊密連接跨膜蛋白-5（claudin-5）可以調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性，維持緊密連接結(jié)構(gòu)和屏障功能。大量研究表明，HPA軸的皮質(zhì)醇（CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）和促腎上腺皮質(zhì)素（ACTH）變化在疲勞發(fā)展中起著重要作用。此外，針灸可以通過干擾腸腦軸的各個方面來調(diào)節(jié)腸道微生物群的紊亂，恢復(fù)體內(nèi)平衡。所以，作者研究了乳腺癌化療后CRF小鼠模型中針灸對疲勞行為、腸道菌群、腸道炎癥、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、腸道屏障和HPA軸的影響及血清代謝物的變化，以闡述針灸治療的抗疲勞機(jī)制。
材料和方法
1 動物和細(xì)胞
40只6-8周齡SPF BALB/c雌性小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。4T1熒光素酶小鼠乳腺癌細(xì)胞，置于RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
2 分組和建模
采用隨機(jī)分組法，將40只雌性小鼠隨機(jī)分為4組（n=10/組）：（1）Control組，正常喂養(yǎng)，不做任何干預(yù)；（2）Model組，采用皮下腫瘤移植和環(huán)磷酰胺化療治療（CTX）；（3）Acu組，在成功建模后，所有小鼠在相應(yīng)的治療點(diǎn)接受針灸治療；（4）Sham組，在相應(yīng)治療點(diǎn)附近的非穴位刺激小鼠。
3 實(shí)驗(yàn)
做強(qiáng)迫游泳（FST）及露天試驗(yàn)（OFT）用于疲勞行為驗(yàn)證，并取小鼠腸道內(nèi)容物、腸道組織、海馬組織及血清樣本用于16S、WB、ELASA及血清代謝物等相關(guān)檢測。
研究結(jié)果
1 針灸對乳腺癌BC化療后的抗疲勞作用
首先使用FST和OFT實(shí)驗(yàn)來探索各組小鼠在腫瘤化療和針灸干預(yù)后的疲勞行為。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組強(qiáng)迫游泳不動時間增加（圖2C）。在OFT實(shí)驗(yàn)中，模型組的總行駛距離和在中心區(qū)域花費(fèi)的時間都有所減少（圖2D、E）。與模型組相比，針灸組強(qiáng)迫游泳的不動時間顯著減少（圖2C），總行駛距離和在中心區(qū)域花費(fèi)的時間顯著增加（圖2D、E），而假針灸組和模型組在FST和OFT方面沒有差異。同時，與假針灸組相比，針灸組的強(qiáng)迫游泳不動時間也顯著縮短，總行駛距離和在中心區(qū)域花費(fèi)的時間顯著增加（圖2C-E）。這些數(shù)據(jù)表明，針灸治療對BC化療后的CRF小鼠具有抗疲勞作用。
2 針灸治療調(diào)節(jié)BC化療后CRF小鼠腸道菌群的物種豐度
作者使用16S rRNA測序檢測了癌癥相關(guān)疲勞小鼠化療后腸道微生物群的變化。結(jié)果表明，對照組的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)顯著高于模型組和假針灸組，同時，針灸組的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)也顯著增加（圖3A、B）。PCoA結(jié)果表明，模型組、假針灸組的樣本與對照組完全分離，且針灸組的樣本與對照組的樣本比較接近（圖3C）。上述結(jié)果表明，癌癥相關(guān)疲勞（CRF）小鼠化療后腸道菌群的菌群豐富度、多樣性和物種差異發(fā)生了顯著變化，針灸治療可以有效逆轉(zhuǎn)這種變化。
3 針灸治療改善BC化療后CRF小鼠的腸道屏障、腸道炎癥及神經(jīng)炎癥
在作者的研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組和假針灸組相比，針灸組緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白和緊密連接跨膜蛋白-5等蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖4A、B）。另外，與對照組相比，CRF顯著提高了腸道（圖4C、D）和海馬（圖4E、F）中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平，并且三種促炎因子水平在針灸治療后均被顯著抑制（圖4C-F）。結(jié)果表明，針灸治療可以改善乳腺癌小鼠BC化療后的腸道屏障功能，降低腸道和海馬炎癥反應(yīng)。
4 針灸治療改善小鼠BC化療后HPA軸功能障礙
本研究采用ELISA檢測血清中HPA軸相關(guān)因子的蛋白質(zhì)含量變化。研究表明，與對照組相比，模型組中CRH和CORT水平顯著降低，ACTH水平升高。與模型組相比，針灸組CRH和CORT表達(dá)水平升高，ACTH表達(dá)則受到抑制。且假針灸組和模型組的CRH、CORT和ACTH水平?jīng)]有顯著變化（圖5A-C）。結(jié)果表明，針灸療法通過改善HPA軸功能障礙發(fā)揮抗疲勞作用。
5 針灸治療對BC化療后CRF小鼠血清代謝產(chǎn)物及代謝途徑的影響
基于LC-MS非靶技術(shù)分析各組血清代謝物變化。結(jié)果表明，PCA分析未顯示比較顯著的組間差異（圖6A）。OPLS-DA得分圖顯示，模型組中代謝物與對照組中明顯不同（圖6B），針灸組中代謝物與模型組、假針灸組也存在顯著差異（圖6C、D）。同時各組之間有良好的模型擬合性和可預(yù)測性（圖6E-G）。此外，作者結(jié)合火山圖分析發(fā)現(xiàn)，與模型組、假針灸組相比，針灸組顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物比顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物多。（圖6H、I）。
隨后作者進(jìn)一步篩選出8種主要的差異代謝物，針灸組血清中紅藻膠、N-甲基煙酰胺、4-羥基-1吲哚-3-乙腈、β-甘油磷酸、乙酸香葉酯、氧化苯乙烯、5-羥色胺和乙酰腎上腺素的水平高于模型組和假針灸組，這些主要差異代謝物在對照組中也高度表達(dá)（圖6J）。此外，作者使用KEGG數(shù)據(jù)庫分析了差異代謝相關(guān)代謝途徑，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、牛磺酸和亞�；撬岽x、苯丙氨酸代謝和β-丙氨酸代謝是針灸治療后的主要差異代謝途徑�？偟膩碚f，針灸治療可以調(diào)節(jié)BC癌癥相關(guān)疲勞小鼠在BC化療后的血清代謝物和代謝途徑變化。
6 腸道菌群與腸道屏障、腸道和海馬炎癥、HPA軸及血清代謝物的相關(guān)性分析
最后，作者使用Spearman分析方法分析了模型組和對照組之間主要的差異菌群和腸道屏障、腸道炎癥、神經(jīng)炎癥、HPA軸功能變化及血清差異代謝物的相關(guān)性。結(jié)果顯示，伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌與腸道緊密連接蛋白、CORT和CRH呈負(fù)相關(guān)，而乳酸桿菌和未分類梭狀芽孢桿菌-UCG-014與腸道緊密連接蛋白、CORT和CRH呈正相關(guān)。鏈球菌、大腸桿菌志賀氏菌、伯克霍爾德菌與炎癥因子、ACTH呈正相關(guān)，而乳酸菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014與炎癥因子、ACTH呈負(fù)相關(guān)（圖7B-D）。此外，乳酸桿菌、分節(jié)絲狀菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014與8種差異代謝物呈正相關(guān)，而伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌與8種差異代謝物呈負(fù)相關(guān)（圖7E）。
研究結(jié)論
研究結(jié)果表明，針灸治療可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道屏障和HPA軸功能障礙，抑制腸道炎癥和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)乳腺癌化療后CRF小鼠模型的腸道微生態(tài)平衡和血清代謝物變化，緩解疲勞癥狀。以上結(jié)果表明，針灸治療的抗疲勞機(jī)制可能與腸道微生物群-腸-腦軸密切相關(guān)。此外，本研究為乳腺癌化療后癌癥相關(guān)疲勞CRF的基礎(chǔ)和臨床研究提供了新的參考。
發(fā)表期刊：Frontiers in Endocrinology
影響因子：6.055
作者單位：河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院
百趣生物提供服務(wù)：發(fā)現(xiàn)代謝組學(xué)Classic-親水版+腸道菌群測序
研究背景
癌癥相關(guān)疲勞（CRF）是癌癥治療后最常見的不良反應(yīng)。CRF在乳腺癌（BC）存活者中比其他癌癥存活者更為常見。研究發(fā)現(xiàn)，接受化療治療的患者CRF發(fā)生率為70%-100%，且患者的疲勞程度明顯比未接受化療的患者嚴(yán)重�；熆梢酝ㄟ^破壞生理屏障的通透性來激活外周促炎細(xì)胞因子并引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，而生理屏障的滲透性反過來又會導(dǎo)致下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸功能障礙，最終導(dǎo)致CRF。而緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白（occludin）和緊密連接跨膜蛋白-5（claudin-5）可以調(diào)節(jié)細(xì)胞通透性，維持緊密連接結(jié)構(gòu)和屏障功能。大量研究表明，HPA軸的皮質(zhì)醇（CORT）、促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）和促腎上腺皮質(zhì)素（ACTH）變化在疲勞發(fā)展中起著重要作用。此外，針灸可以通過干擾腸腦軸的各個方面來調(diào)節(jié)腸道微生物群的紊亂，恢復(fù)體內(nèi)平衡。所以，作者研究了乳腺癌化療后CRF小鼠模型中針灸對疲勞行為、腸道菌群、腸道炎癥、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、腸道屏障和HPA軸的影響及血清代謝物的變化，以闡述針灸治療的抗疲勞機(jī)制。
材料和方法
1 動物和細(xì)胞
40只6-8周齡SPF BALB/c雌性小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。4T1熒光素酶小鼠乳腺癌細(xì)胞，置于RPMI-1640培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。
2 分組和建模
采用隨機(jī)分組法，將40只雌性小鼠隨機(jī)分為4組（n=10/組）：（1）Control組，正常喂養(yǎng)，不做任何干預(yù)；（2）Model組，采用皮下腫瘤移植和環(huán)磷酰胺化療治療（CTX）；（3）Acu組，在成功建模后，所有小鼠在相應(yīng)的治療點(diǎn)接受針灸治療；（4）Sham組，在相應(yīng)治療點(diǎn)附近的非穴位刺激小鼠。
3 實(shí)驗(yàn)
做強(qiáng)迫游泳（FST）及露天試驗(yàn)（OFT）用于疲勞行為驗(yàn)證，并取小鼠腸道內(nèi)容物、腸道組織、海馬組織及血清樣本用于16S、WB、ELASA及血清代謝物等相關(guān)檢測。
圖1. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
研究結(jié)果
1 針灸對乳腺癌BC化療后的抗疲勞作用
首先使用FST和OFT實(shí)驗(yàn)來探索各組小鼠在腫瘤化療和針灸干預(yù)后的疲勞行為。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組強(qiáng)迫游泳不動時間增加（圖2C）。在OFT實(shí)驗(yàn)中，模型組的總行駛距離和在中心區(qū)域花費(fèi)的時間都有所減少（圖2D、E）。與模型組相比，針灸組強(qiáng)迫游泳的不動時間顯著減少（圖2C），總行駛距離和在中心區(qū)域花費(fèi)的時間顯著增加（圖2D、E），而假針灸組和模型組在FST和OFT方面沒有差異。同時，與假針灸組相比，針灸組的強(qiáng)迫游泳不動時間也顯著縮短，總行駛距離和在中心區(qū)域花費(fèi)的時間顯著增加（圖2C-E）。這些數(shù)據(jù)表明，針灸治療對BC化療后的CRF小鼠具有抗疲勞作用。
圖2. 針灸對乳腺癌BC化療后的抗疲勞作用
2 針灸治療調(diào)節(jié)BC化療后CRF小鼠腸道菌群的物種豐度
作者使用16S rRNA測序檢測了癌癥相關(guān)疲勞小鼠化療后腸道微生物群的變化。結(jié)果表明，對照組的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)顯著高于模型組和假針灸組，同時，針灸組的香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)也顯著增加（圖3A、B）。PCoA結(jié)果表明，模型組、假針灸組的樣本與對照組完全分離，且針灸組的樣本與對照組的樣本比較接近（圖3C）。上述結(jié)果表明，癌癥相關(guān)疲勞（CRF）小鼠化療后腸道菌群的菌群豐富度、多樣性和物種差異發(fā)生了顯著變化，針灸治療可以有效逆轉(zhuǎn)這種變化。
圖3. 針灸治療調(diào)節(jié)BC化療后CRF小鼠腸道菌群的物種豐度
隨后作者在門屬水平上統(tǒng)計(jì)了每組相對豐度前30名的物種，并繪制了豐度直方圖�？煽闯鲈陂T水平上，與對照組相比，模型組和假針灸組的變形桿菌豐度顯著增加，擬桿菌和髕骨細(xì)菌豐度明顯降低。與模型組和假針灸組相比，針灸組中厚壁菌、擬桿菌和髕骨細(xì)菌的豐度顯著增加，變形菌門的豐度明顯降低。在屬水平上，與對照組相比，模型組中的伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌和鏈球菌的豐度較高，而乳酸桿菌、未分類擬桿菌、分節(jié)絲狀菌和梭狀芽孢桿菌較低。與模型組和假針灸組相比，針灸組中的伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌的豐度有所下降，而乳酸桿菌，未分類擬桿菌、分節(jié)絲狀菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014的豐度則有所增加（圖3E）。根據(jù)LEfSe分析，acu組的乳酸桿菌豐度高于模型組和假針灸組（圖3F、G）。此外，根據(jù)物種豐度表，基于屬水平進(jìn)行了組間顯著差異分析。作者發(fā)現(xiàn)針灸后乳酸桿菌水平顯著升高（圖3H、I）。以上結(jié)果表明，針灸治療可以改善BC相關(guān)疲勞小鼠化療后腸道菌群的失衡，增加有益細(xì)菌的含量。3 針灸治療改善BC化療后CRF小鼠的腸道屏障、腸道炎癥及神經(jīng)炎癥
在作者的研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組和假針灸組相比，針灸組緊密連接蛋白ZO-1、閉合蛋白和緊密連接跨膜蛋白-5等蛋白表達(dá)水平顯著升高（圖4A、B）。另外，與對照組相比，CRF顯著提高了腸道（圖4C、D）和海馬（圖4E、F）中促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)水平，并且三種促炎因子水平在針灸治療后均被顯著抑制（圖4C-F）。結(jié)果表明，針灸治療可以改善乳腺癌小鼠BC化療后的腸道屏障功能，降低腸道和海馬炎癥反應(yīng)。
圖4. 針灸治療改善BC化療后CRF小鼠的腸道屏障、腸道炎癥及神經(jīng)炎癥
4 針灸治療改善小鼠BC化療后HPA軸功能障礙
本研究采用ELISA檢測血清中HPA軸相關(guān)因子的蛋白質(zhì)含量變化。研究表明，與對照組相比，模型組中CRH和CORT水平顯著降低，ACTH水平升高。與模型組相比，針灸組CRH和CORT表達(dá)水平升高，ACTH表達(dá)則受到抑制。且假針灸組和模型組的CRH、CORT和ACTH水平?jīng)]有顯著變化（圖5A-C）。結(jié)果表明，針灸療法通過改善HPA軸功能障礙發(fā)揮抗疲勞作用。
圖5. 針灸治療改善小鼠BC化療后HPA軸功能障礙
5 針灸治療對BC化療后CRF小鼠血清代謝產(chǎn)物及代謝途徑的影響
基于LC-MS非靶技術(shù)分析各組血清代謝物變化。結(jié)果表明，PCA分析未顯示比較顯著的組間差異（圖6A）。OPLS-DA得分圖顯示，模型組中代謝物與對照組中明顯不同（圖6B），針灸組中代謝物與模型組、假針灸組也存在顯著差異（圖6C、D）。同時各組之間有良好的模型擬合性和可預(yù)測性（圖6E-G）。此外，作者結(jié)合火山圖分析發(fā)現(xiàn)，與模型組、假針灸組相比，針灸組顯著上調(diào)的代謝產(chǎn)物比顯著下調(diào)的代謝產(chǎn)物多。（圖6H、I）。
隨后作者進(jìn)一步篩選出8種主要的差異代謝物，針灸組血清中紅藻膠、N-甲基煙酰胺、4-羥基-1吲哚-3-乙腈、β-甘油磷酸、乙酸香葉酯、氧化苯乙烯、5-羥色胺和乙酰腎上腺素的水平高于模型組和假針灸組，這些主要差異代謝物在對照組中也高度表達(dá)（圖6J）。此外，作者使用KEGG數(shù)據(jù)庫分析了差異代謝相關(guān)代謝途徑，發(fā)現(xiàn)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成、牛磺酸和亞�；撬岽x、苯丙氨酸代謝和β-丙氨酸代謝是針灸治療后的主要差異代謝途徑�？偟膩碚f，針灸治療可以調(diào)節(jié)BC癌癥相關(guān)疲勞小鼠在BC化療后的血清代謝物和代謝途徑變化。
圖6. 針灸治療對BC化療后CRF小鼠血清代謝產(chǎn)物及代謝途徑的影響
6 腸道菌群與腸道屏障、腸道和海馬炎癥、HPA軸及血清代謝物的相關(guān)性分析
最后，作者使用Spearman分析方法分析了模型組和對照組之間主要的差異菌群和腸道屏障、腸道炎癥、神經(jīng)炎癥、HPA軸功能變化及血清差異代謝物的相關(guān)性。結(jié)果顯示，伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌與腸道緊密連接蛋白、CORT和CRH呈負(fù)相關(guān)，而乳酸桿菌和未分類梭狀芽孢桿菌-UCG-014與腸道緊密連接蛋白、CORT和CRH呈正相關(guān)。鏈球菌、大腸桿菌志賀氏菌、伯克霍爾德菌與炎癥因子、ACTH呈正相關(guān)，而乳酸菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014與炎癥因子、ACTH呈負(fù)相關(guān)（圖7B-D）。此外，乳酸桿菌、分節(jié)絲狀菌和未分類梭狀芽孢桿菌UCG-014與8種差異代謝物呈正相關(guān)，而伯克霍爾德菌、大腸桿菌志賀氏菌、鏈球菌與8種差異代謝物呈負(fù)相關(guān)（圖7E）。
圖7. 腸道菌群與腸道屏障、腸道和海馬炎癥、HPA軸及血清代謝物的相關(guān)性分析
研究結(jié)論
研究結(jié)果表明，針灸治療可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群，改善腸道屏障和HPA軸功能障礙，抑制腸道炎癥和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)乳腺癌化療后CRF小鼠模型的腸道微生態(tài)平衡和血清代謝物變化，緩解疲勞癥狀。以上結(jié)果表明，針灸治療的抗疲勞機(jī)制可能與腸道微生物群-腸-腦軸密切相關(guān)。此外，本研究為乳腺癌化療后癌癥相關(guān)疲勞CRF的基礎(chǔ)和臨床研究提供了新的參考。
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