貼壁細(xì)胞及懸浮細(xì)胞的傳代方法及流程

一、貼壁細(xì)胞的傳代所需材料

· 裝有貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)容器

· 經(jīng)過組織培養(yǎng)處理的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿

· 完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，預(yù)熱至 37℃

· 一次性無(wú)菌15ml試管

· 37℃ 培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為 5% 的濕化空氣

· 平衡鹽溶液，例如：杜爾貝科磷酸鹽緩沖液 (DPBS)，不含鈣、鎂和酚紅

· 消化酶，例如：胰蛋白酶，不含酚紅

二、貼壁細(xì)胞傳代流程

細(xì)胞培養(yǎng)一定要保持工作區(qū)的無(wú)菌清潔，先用紫外燈和臭氧殺菌1h，然后通風(fēng)30min，操作前需要換細(xì)胞間專用拖鞋，雙手帶上一次性橡膠手套并用75%乙醇消毒，穿上實(shí)驗(yàn)服，戴上一次性口罩和帽子，整個(gè)無(wú)菌操作都應(yīng)該在酒精燈的周圍進(jìn)行。

1. 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的貼壁細(xì)胞，棄掉舊培養(yǎng)基。

2. 用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗細(xì)胞1-2遍。 (每10 cm2 培養(yǎng)表面積需要2 ml 溶液)。從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入沖洗液，以避免攪動(dòng)細(xì)胞層，前后搖晃容器數(shù)次。

注：沖洗步驟可去除可能抑制消化酶作用的少量血清、鈣和鎂。

3. 從培養(yǎng)容器中吸出沖洗液并丟棄。

4. 向培養(yǎng)瓶中加入預(yù)熱的消化酶(例如：胰蛋白酶)；試劑量應(yīng)足以覆蓋細(xì)胞層 (每10 cm2 大約0.5ml)。輕輕搖晃容器，使試劑完全覆蓋細(xì)胞層。

5. 將培養(yǎng)容器在室溫下孵育約2分鐘。

請(qǐng)注意，實(shí)際孵育時(shí)間根據(jù)所用細(xì)胞系不同可能有所差異。

6. 在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離情況。如果解離程度未達(dá)90%，可將孵育時(shí)間延長(zhǎng)幾分鐘，每30秒鐘檢查一次解離情況。也可輕輕拍打培養(yǎng)容器以加快細(xì)胞解離。

7. 細(xì)胞解離程度大于等于90%時(shí)，傾斜培養(yǎng)容器，使細(xì)胞上液體盡快流盡。加入所用消化酶兩倍體積的預(yù)熱完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基。輕柔吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使細(xì)胞分散，成為單細(xì)胞懸液。

8. 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到 15ml 離心管中，200g 離心5至10分鐘。

請(qǐng)注意，離心速度和時(shí)間依細(xì)胞種類不同而有所差異。

9. 用最少體積的預(yù)熱完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基重新懸浮細(xì)胞沉淀。

注：此時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)

10.將細(xì)胞懸液稀釋到該細(xì)胞系推薦的接種密度，并將適量體積的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到新的細(xì)胞培養(yǎng)容器中，把細(xì)胞放回培養(yǎng)箱。

注：如果使用培養(yǎng)瓶，將其放入培養(yǎng)箱前應(yīng)將瓶蓋旋松，以便進(jìn)行充分的氣體交換，除非您使用的是通氣式培養(yǎng)瓶和透氣性瓶蓋。

三、懸浮細(xì)胞的傳代

懸浮細(xì)胞傳代比貼壁細(xì)胞傳代稍微簡(jiǎn)單一些。由于細(xì)胞已經(jīng)在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中懸浮，因此無(wú)需通過酶的作用使其從培養(yǎng)容器表面脫離，整個(gè)過程較為迅速，對(duì)細(xì)胞的損傷也較小。懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)要比貼壁細(xì)胞簡(jiǎn)單得多，通常有兩種方法。

1．直接給帶傳代的培養(yǎng)瓶中補(bǔ)充一定量的新鮮培養(yǎng)基，然后將進(jìn)行分裝。

2．先通過離心棄掉營(yíng)養(yǎng)匱乏的舊培養(yǎng)基，然后再用適量的新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞沉淀，最后將其分裝至培養(yǎng)瓶中即可。

懸浮細(xì)胞傳代后的延滯期一般比貼壁細(xì)胞短。

四、所需材料

• 裝有懸浮細(xì)胞的培養(yǎng)容器

• 完全生長(zhǎng)培養(yǎng)基，預(yù)熱至37℃

• 37℃培養(yǎng)箱，充有二氧化碳濃度為5%的濕化空氣

五、懸浮細(xì)胞傳代流程

所有與細(xì)胞接觸的溶液和設(shè)備均應(yīng)為無(wú)菌狀態(tài)。必須采用正確的無(wú)菌技術(shù)，并且在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。傳代應(yīng)在細(xì)胞處于對(duì)數(shù)期、未達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)進(jìn)行。達(dá)到匯合狀態(tài)時(shí)，懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞會(huì)聚集成團(tuán)塊，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶時(shí)培養(yǎng)基會(huì)變得渾濁。傳代前所建議的最大細(xì)胞密度隨細(xì)胞系不同而有所差異；詳細(xì)信息請(qǐng)參閱針對(duì)具體細(xì)胞的產(chǎn)品說明書或操作手冊(cè)。

六、懸浮細(xì)胞的傳代方法有2種

1、直接傳代法：

①待懸浮細(xì)胞長(zhǎng)滿至80%-90%左右（細(xì)胞懸液變黃），即可傳代；

②用吸管吸棄細(xì)胞懸液1/2～2/3；

③加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。

2、離心傳代法：

①將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)；

②150g離心5min，棄上清；

③使用新鮮的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；

④吸管吸取適量細(xì)胞懸液，裝入新的培養(yǎng)瓶，再加入適量的新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。