淺談納米抗體與嵌合抗原受體T細胞療法

1989年，研究人員在駱駝的血液樣本中發(fā)現(xiàn)了一種具有特殊功效的重鏈抗體，其可變區(qū)域擁有與抗原的完全結合的特點。為此，Ablynx公司研制出一種只包含VHH片段的抗體，該抗體尺寸極為細小，進一步引出了納米抗體（Nanobody）的學術概念。

圖1 納米抗體

納米抗體具有獨特的結構和功能，例如強大的穿透性、穩(wěn)定性和良好的水溶性，因此在疾病治療、診斷和物質檢測等領域受到了廣泛關注。由于納米抗體的體積較小，且缺乏抗體保守區(qū)域，因此，在進行生物學分析時，面臨著更大的挑戰(zhàn)。本文將深入探討納米抗體的結構、功能、藥代動力學特征，并提出一種新的、具有通用性的ELISA系統(tǒng)（USCE），可以在不需要使用特異性試劑的情況下，快速、準確地建立一種靈敏的ELISA方法，從而大大減少了早期研發(fā)中生物分析的開發(fā)難度。

一、納米抗體結構和功能介紹

根據(jù)圖2，納米抗體具有多種結構特征，這些特征與其功能密切相關，簡而言之，它們的結構和功能特征如下：

（1）體積�。ǚ肿恿啃。�：由于其結構僅包含重鏈可變區(qū)，使得該物質具有分子量極低（~15kd），這使得其具有更強的組織穿透性，并且在藥物性能上具有極大的潛力。近年來隨著心腦血管、癌癥的患者越來越多，抗體藥物展現(xiàn)出巨大的發(fā)展前景，針對不同的靶點，各個生物公司研發(fā)出不同的抗體藥物用以治療相應的病癥，如治療腫瘤微血管生成的貝伐珠單抗，（Cat：TKYR1001），羅氏公司研發(fā)的治療淋巴瘤的利妥昔單抗（Cat：TKYR1004）等。2018年9月，EMA批準比利時生物技術公司Ablynx申請上市的全球首款納米抗體藥物caplacizumab（Cat：TKYR1265）。Caplacizumab是一個抗von Willebrand 因子（vWF）納米抗體，用于治療一種叫做獲得性血栓性血小板減少性紫癜（aTTP）的罕見病，為納米抗體藥物的研發(fā)開啟了新的征程。

圖2. 納米抗體基本結構以及和單抗的比較

（2）具備CDR1, CDR2, CDR3（Complementarity-determining region）互補決定區(qū)，和骨架區(qū)域FR （framework region），如圖3。在FR2區(qū)域，具有高度保守的親水性氨基酸，而在IgG 重鏈可變區(qū)（VH），則具有更高的保守性，其上的氨基酸更加親水/更小，如F42 or Y42、 E49、 R50 and G52和 R50 and G52。由于疏水相互作用的存在，IgG VH和vl之間形成了6個CDR區(qū)域，從而使得它們能夠穩(wěn)定地結合在一起，而VHH的親水性則有助于它們在單體狀態(tài)下保持穩(wěn)定，避免了聚集的可能性。然而，當IgG VL VH濃度較高時，也會出現(xiàn)聚集和錯配的情況。

圖3. IgG VH和重鏈抗體VHH的CDR和FR區(qū)域示意圖

（3）相比于IgG，納米抗體VHH的CDR3區(qū)域更加寬闊，這樣就能夠填補VL domain的不足。CDR3區(qū)域的寬度決定了納米抗體VHH的特異性，同時也保證了其與抗原之間的強結合。此外，納米抗體還能夠延伸至一些常規(guī)抗體無法到達的表位（epitope）。

（4）納米抗體VHH其內部存在環(huán)間二硫鍵，這些額外的二硫鍵幫助其在惡劣環(huán)境中仍然可以維持構象的穩(wěn)定，納米抗體往往相對常規(guī)抗體更耐高溫，酸堿pH或有機溶劑。

（5）納米抗體易在細菌、酵母、真菌等微生物系統(tǒng)中進行體外原核/真核細胞的表達擴增，從而能夠以較低的成本進行大量生產。泰克生物建立了一套完整的蛋白表達，蛋白發(fā)酵，蛋白小試與中試規(guī)模的工藝技術支持�？梢蕴峁�原核表達、酵母表達、哺乳動物表達、昆蟲表達等多種表達系統(tǒng)，泰克生物制備納米抗體使用哺乳動物表達體系，包括但不限于FreeStyle 293-F cell line和Expi CHO-S等細胞系，配合泰克生物設計的高表達載體（含有全長的CMV啟動子以及優(yōu)化后的分泌信號肽序列）進行重組抗體表達與制備。

納米抗體是一種由駱駝科動物產生的抗原結合物，其可變區(qū)域可以是VHH，也可以是Ig-NAR（new antigen receptor），甚至可以是variable new antigen receptor，它們都是抗原結合物中最小的形式，如圖4所示。其僅含有CDR1和CDR3，而且分子量極低（~12kd）。

圖4. IgG，駱駝科動物產生的重鏈抗體和鯊魚等軟骨魚類產生的IgNAR抗體比較

二、納米抗體的藥代動力學性質及優(yōu)化策略

由于結構上的相似性，納米抗體單體之間在ADME特征上存在一定的共性，如圖5所示，二者之間具有一些共同的特征，可以用來指導抗體的應用。

圖5. 納米抗體單體ADME特征總結

通常來說，納米抗體的吸收具有非線性藥代動力學特征，血漿藥物達到峰值后迅速下降（IV,SC）。IV給藥的Cmax呈線性增加，而AUC則呈非線性增加，且增加幅度低于劑量比例。納米抗體通常存在于血液循環(huán)中，如腎臟和肝臟。其代謝和排泄主要通過腎臟進行，但也可能通過肝臟或ADA介導的方式進行。

盡管納米抗體具有獨特的優(yōu)勢，但也存在明顯的缺陷，為了滿足藥物性能的需求，納米抗體結構的優(yōu)化通常會從以下幾個方面進行：

人源化：VHH抗體是一種來自全駱駝的抗體，其免疫原性很強，所以通常需要經過人工處理。然而，完全人工處理后的VHH抗體會將FR2區(qū)域的親水氨基酸轉化為疏水氨基酸，這會導致溶解度和穩(wěn)定性的問題。因此，通常需要對VHH抗體進行部分人工處理，以保留FR2區(qū)域的親水氨基酸，這樣的VHH抗體的免疫原性較弱，溶解度和穩(wěn)定性也更好。

二聚/多聚化：通過二聚或多聚化，納米抗體可以針對不同的靶蛋白，甚至是同一種蛋白的不同表位，從而提供更多的治療機制，并且延長其半衰期。

偶聯(lián)半衰期延長物（half-life extender）：通過設計特定的蛋白質偶聯(lián)，或者針對HAS的血清白蛋白，可以顯著延長VHH單體的半衰期，從而提高其生物學功能。這種方法通常被用于治療糖尿病，如血糖異常、糖尿病腎病等。

小結

納米抗體具有顯著的優(yōu)勢，如體積小、穿透力強、穩(wěn)定性好、水溶性好等，因此在治療疾病、診斷和物質檢測等領域受到廣泛關注。近年來，通過多種修飾手段，納米抗體的應用范圍得到了進一步拓展，其成藥性、生物檢測等方面的優(yōu)勢和劣勢也得到了明顯的體現(xiàn)。