精密氧氣控制系統(tǒng)在用于類器官培養(yǎng)的應(yīng)用

類 器 官 簡 介

類器官 (Organoid)是在體外，經(jīng)過3D培養(yǎng)，能夠在體外模擬正常（或疾病）狀態(tài)下體內(nèi)器官（或組織）的三維結(jié)構(gòu)和生理功能。通俗點(diǎn)講，類器官是三維細(xì)胞培養(yǎng)物，將干細(xì)胞培養(yǎng)于基質(zhì)膠中，在化學(xué)小分子抑制劑/激活劑、細(xì)胞因子、培養(yǎng)基添加劑等物質(zhì)作用下經(jīng)過培養(yǎng)得到的相應(yīng)器官類似的組織結(jié)構(gòu)。

類器官擁有自我更新能力，能維持來源組織的生理結(jié)構(gòu)和功能，享有“培養(yǎng)皿中的微器官”之稱。利用干細(xì)胞的自我更新、分化能力以及自我組織能力，類器官可冷凍保存用作生物庫，也能無限擴(kuò)增。類器官高度復(fù)雜，相對于2D細(xì)胞，更接近于體內(nèi)狀態(tài)。

最近的研究表明，類器官可以用來模擬器官發(fā)育和疾病，在基礎(chǔ)研究、藥物發(fā)現(xiàn)和再生醫(yī)學(xué)中有著廣泛的應(yīng)用。研究人員現(xiàn)在開始從其他領(lǐng)域(如生物工程)獲得靈感，以產(chǎn)生與生理更相關(guān)、更適合于現(xiàn)實應(yīng)用的類器官。在這里我們主要描述類器官在基礎(chǔ)生物學(xué)、疾病模型和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的現(xiàn)有和新興應(yīng)用。

01

類器官的主要應(yīng)用

圖1 類器官的主要應(yīng)用
 

1.類器官作為發(fā)育、平衡和再生的模型

類器官在體外重現(xiàn)了器官生物學(xué)的一些原理，并提供了簡化且易于獲得的“最小系統(tǒng)”，用于識別不同組織成分對復(fù)雜形態(tài)發(fā)生過程的相對貢獻(xiàn)（圖1a）。

2. 建立疾病損傷模型

類器官誘導(dǎo)的特定組織或器官，可用于特定疾病模型的研究。與傳統(tǒng)的單一細(xì)胞類型的細(xì)胞培養(yǎng)物相比，類器官培養(yǎng)物用于疾病建模的一個明顯優(yōu)勢是它們能夠在器官水平上模擬病變（圖1b）。

此外，來自人類ASCs或誘導(dǎo)PSCs（iPSCs）的類器官可以作為人類疾病的模型，再現(xiàn)與轉(zhuǎn)化研究有關(guān)的特定人類特征。目前已經(jīng)開發(fā)了多種基于類器官的疾病模型，再現(xiàn)了遺傳性疾病^[1-4]、宿主-病原體相互作用[^5-8]或癌癥^[9-11]，并提供了類器官可以再現(xiàn)某些著名病理特征的原理證明（圖1b）。

3. 藥物篩選

來源于干細(xì)胞的類器官能夠用于藥物反應(yīng)的離體測試，為藥篩提供理論支持。類器官可以模擬人類病理過程為藥物測試和篩選應(yīng)用的可行性研究提供了新途徑（圖1c）。

4. 藥物毒性和功效測試

利用類器官來驗證新藥在特定器官或組織的藥代毒性，為新藥研發(fā)提供數(shù)據(jù)支持。在個性化醫(yī)療中，患者特異性類器官可以幫助為每個患者確定最佳藥物。

5. 再生醫(yī)學(xué)

干細(xì)胞來源的類器官，能夠修復(fù)或替代受損或病變的組織以恢復(fù)正常的組織功能，在細(xì)胞療法上具有廣泛的應(yīng)用價值，包括用于其他神經(jīng)退行性疾病、糖尿病、心血管疾病、視網(wǎng)膜病變和脊柱損傷等。類器官正在成為可移植組織和功能細(xì)胞類型的潛在來源，用于再生醫(yī)學(xué)細(xì)胞治療(圖1e)。

另外，類器官用于再生醫(yī)學(xué)可以與體外基因矯正策略相結(jié)合，從而能夠自體替換受遺傳疾病影響的組織。在一項原理驗證研究中，CRISPR-Cas9介導(dǎo)的基因編輯用于糾正患者來源的ISCs中導(dǎo)致CF的最常見的CFTR突變，即508位苯丙氨酸的缺失，然后用于產(chǎn)生功能性類器官^[12]（圖1e）。

 

類器官的類型非常豐富，主要包括腸道（小腸/結(jié)腸）、胃、肝臟、心臟、肺、前列腺、胰腺、腎臟、乳腺、腦類、視網(wǎng)膜以及內(nèi)耳等。根據(jù)類器官類型的不同，其對于生長環(huán)境比如氣體環(huán)境O₂、CO₂ 濃度的要求會有所不同。以下是使用BioSpherix Xvivo System 培養(yǎng)類器官的具體實例。

02

應(yīng)用實例1
題目：Distinct Vulnerability and Resilience of Human Neuroprogenitor Subtypes in Cerebral Organoid Model of Prenatal Hypoxic Injury ^[13]

產(chǎn)前缺氧性損傷（Hypoxic Injury HI）是導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)殘疾的主要原因。在人類大腦早期發(fā)育過程中，缺氧對祖細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和發(fā)育進(jìn)程的即時和長期影響尚不清楚。在這篇研究中使用人大腦類器官復(fù)制了一個瞬態(tài)HI模型。

D0表示人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cells, hESCs）分化的開始日，D14表示類器官轉(zhuǎn)移到軌道振蕩器上培養(yǎng)的時間。在D28，類器官在缺氧室（BioSpherix, Xvivo System）中接受3%O₂處理24小時，然后切換回常氧條件（21%O₂，5%CO₂），直到分析。

圖2 具有hESC衍生的腦類器官的短暫性缺氧損傷（HI）模型的示意圖。
 

圖3 人類大腦類器官的短暫缺氧模型
 

研究結(jié)果證明，短暫缺氧可誘導(dǎo)大腦類器官的DNA立即損傷和細(xì)胞凋亡延長，橈骨外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞（outer radial glia, oRG）是靈長類動物中更為突出的祖細(xì)胞群體，分化的神經(jīng)母細(xì)胞/未成熟神經(jīng)元損失更大。相反，心室區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞對HI表現(xiàn)出相對的彈性，并表現(xiàn)出有利于對稱分裂的切割平面角的偏移，從而提供了補(bǔ)充干細(xì)胞庫的機(jī)制。此外，我們定義了對HI特別敏感的脆弱窗口和神經(jīng)分化階段。了解產(chǎn)前HI對人類神經(jīng)祖細(xì)胞亞型在早期皮質(zhì)發(fā)生過程中的存活和有絲分裂行為的細(xì)胞類型特異性和階段依賴性影響，有助于闡明神經(jīng)發(fā)育障礙的病因，并提供一個治療起點(diǎn)，在關(guān)鍵時間段保護(hù)脆弱人群。

應(yīng)用實例2
題目：Automating iPSC generation to enable autologous photoreceptor cell replacement therapy ^[14]

遺傳性視網(wǎng)膜變性是發(fā)達(dá)國家無法治愈的視力損失的主要原因。雖然自體多能干細(xì)胞(pluripotent stem cells，iPSC)介導(dǎo)的光感受器細(xì)胞替代在理論上是可能的，但由于缺乏高通量平行生產(chǎn)病人特定療法的商業(yè)化技術(shù)阻礙了臨床轉(zhuǎn)化。

在這項研究中使用Cell X精密機(jī)器人細(xì)胞培養(yǎng)平臺來實現(xiàn)臨床級病人特定iPSCs的平行生產(chǎn)。Cell X被安置在符合ISO 5級cGMP標(biāo)準(zhǔn)的封閉式無菌活細(xì)胞工作站(BioSpherix, Xvivo System）內(nèi)（O₂濃度在20% -10% -20%變化），在這里進(jìn)行從成纖維細(xì)胞培養(yǎng)到iPSC生成、克隆擴(kuò)增和視網(wǎng)膜分化的所有程序。

圖4 用于從原代真皮成纖維細(xì)胞自動生成iPSC的Cell X機(jī)器人平臺。
 

圖5 在Cell X平臺上產(chǎn)生的iPSCs的視網(wǎng)膜分化。
 

研究結(jié)果表明，使用Cell X平臺生成的患者iPSCs通過評分卡分析被確定為多能性，并通過核型確定為基因穩(wěn)定。通過免疫染色和共聚焦顯微鏡確定，使用Cell X平臺產(chǎn)生的iPSCs產(chǎn)生了視網(wǎng)膜器官，與人工產(chǎn)生的iPSCs產(chǎn)生的器官沒有區(qū)別。此外，在分化后120天，單細(xì)胞RNA測序分析顯示，使用Cell X平臺產(chǎn)生的細(xì)胞與在單獨(dú)實驗室手工條件下產(chǎn)生的細(xì)胞相當(dāng)�？傊�，該團(tuán)隊成功開發(fā)了一個機(jī)器人iPSC生成平臺和標(biāo)準(zhǔn)操作程序，用于生產(chǎn)高質(zhì)量的光感受器前體細(xì)胞，與目前的良好生產(chǎn)規(guī)范相兼容。這個系統(tǒng)將使臨床級的iPSCs生產(chǎn)能夠用于自體視網(wǎng)膜細(xì)胞替代。

 

 

產(chǎn)品

介紹

Xvivo System活細(xì)胞工作站旨在超越人們的普通需求，并專門解決細(xì)胞（例如：類器官）高級需求的系統(tǒng)，給細(xì)胞（例如：類器官）還原真實的生理/病理環(huán)境，助力每一位使用的科研先鋒取得更可靠的成果。

圖6 兩篇文章中低氧實驗使用Biospherix Xvivo活細(xì)胞工作站

 

產(chǎn)品特點(diǎn)

· 全密閉無干擾系統(tǒng)，內(nèi)部潔凈級別達(dá)到ISO5
· 高效清潔HEPA系統(tǒng)，每小時不低于30次換風(fēng)，流速不低于2.8立方米/分鐘。
· 雙模式無菌環(huán)境，雙區(qū)控溫，培養(yǎng)區(qū)與操作區(qū)互不干擾，創(chuàng)造適合的細(xì)胞生長環(huán)境, 讓細(xì)胞長得更好，研究結(jié)果更具有說服力。
· O₂(0.1-99.9%,精度0.1%)，CO₂(0.1-20%,精度0.1%)探頭置于chamber內(nèi)，精確測量，所測即所得。

 

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