防范轉(zhuǎn)基因花粉擴(kuò)撒：花粉自清除CRISPR/Cas系統(tǒng)(PSEC)的開發(fā)
近年來隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展及在農(nóng)作物育種領(lǐng)域的應(yīng)用，相對于傳統(tǒng)育種周期的8-10年，基因編輯育種可將育種周期縮短至3年左右，并可快速精準(zhǔn)創(chuàng)制新的種質(zhì)資源，有效提高作物產(chǎn)量、抗病蟲害特性及品質(zhì)性狀等。比如基因編輯的水稻品種畝產(chǎn)提高15%以上、油酸含量達(dá)到80%以上的基因編輯大豆、產(chǎn)量提高10%以上的基因編輯玉米、抗除草劑小麥、強(qiáng)化甜度的草莓、強(qiáng)化風(fēng)味的蔬菜等。全球范圍內(nèi)，基因編輯已經(jīng)在水稻、玉米、大豆、小麥和番茄等農(nóng)作物以及豬、牛、羊等農(nóng)業(yè)動(dòng)物中廣泛應(yīng)用，糯玉米、高油酸大豆、抗褐變馬鈴薯、高GABA番茄、抵抗褐變的蘑菇等基因編輯產(chǎn)品陸續(xù)在美國、日本等國家上市推廣。
CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)具有靶向精準(zhǔn)、操作簡便、突變類型豐富、應(yīng)用范圍廣、效率高等突出優(yōu)勢，已成為農(nóng)作物遺傳改良的主要技術(shù)工具。當(dāng)前，通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas是植物基因編輯的主要途徑。然而，有性繁殖植物中，轉(zhuǎn)基因元件可通過植物的花粉向自然與農(nóng)業(yè)環(huán)境中擴(kuò)散傳播。玉米是典型的異交授粉植物，一個(gè)單株可產(chǎn)生200萬至500萬�；ǚ�，可能帶來非預(yù)期的生物安全管理風(fēng)險(xiǎn)。前人已報(bào)道了一種“自殺式”轉(zhuǎn)基因策略，可以產(chǎn)生無轉(zhuǎn)基因的基因編輯植物以解決轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散問題，對無性繁殖植物因無減數(shù)分裂重組以去除轉(zhuǎn)基因成分，該方法也是理想的生物安全管理解決方案。然而，有多個(gè)基因編輯生物育種技術(shù)場景仍需活體中保持CRISPR/Cas存在，持續(xù)發(fā)生基因編輯靶向突變活性。因此，研發(fā)一種既沒有花粉擴(kuò)散轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)，又能保持基因編輯元件穩(wěn)定遺傳，且保持高編輯活性的技術(shù)，尤為必要。此外，玉米是世界上主要的糧食作物，緊湊矮桿等耐密株型遺傳改良是當(dāng)代玉米遺傳與育種主要方向，降低株高具有抗倒、增密增產(chǎn)等農(nóng)學(xué)意義。以某個(gè)特定的品種為“底盤”，創(chuàng)制系列降低株高同型衍生品種，對擴(kuò)大該品種適應(yīng)生態(tài)區(qū)域與生產(chǎn)應(yīng)用推廣，具有重要價(jià)值。
近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作科所及西北農(nóng)林科技大學(xué)的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)在《Plant Communications》在線發(fā)表了題為“Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize”的研究論文，介紹了研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種花粉自清除CRISPR/Cas (PSEC)靶向多個(gè)生長調(diào)節(jié)因子-GRF，通過引入花粉特異表達(dá)的能量耗竭元件，成功實(shí)現(xiàn)了含有PSEC元件的單倍體花粉不育，導(dǎo)致玉米植株世代穩(wěn)定維持PSEC元件半合子雜合體，PSEC僅能通過雌性配子體向下一代遺傳。同時(shí)，利用玉米植株中PSEC可跨世代保持高效的靶向ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6基因編輯活性，基于同一個(gè)材料創(chuàng)制出系列株高版本的同型衍生品系。
為了開發(fā)程序化的PSEC系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)在CRISPR/Cas9載體T-DNA中引入了一個(gè)雄性配子體失活基因，即玉米α-淀粉酶基因ZmAA1，該基因由一個(gè)花粉特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（Polygalacturonase 47, ZmPG47）（圖1A）。含有PSEC轉(zhuǎn)基因的花粉是不能存活的，但PSEC轉(zhuǎn)基因可以通過雌配子體遺傳給下一代（圖1B）。與受體材料雜交時(shí)，PSEC的Cas編輯活性被保留下來，并能產(chǎn)生新的等位基因靶向突變（圖1C）。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了PSEC來靶向編碼三種生長調(diào)節(jié)因子的基因，即ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6，并獲得了單一或多個(gè)突變體（圖1A）。
研究團(tuán)隊(duì)利用PSEC針對玉米自交系ZC01的未成熟胚胎進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，結(jié)果分離出25個(gè)獨(dú)立的T0轉(zhuǎn)化體。在對目標(biāo)突變進(jìn)行初步評(píng)估后，研究團(tuán)隊(duì)選擇了5個(gè)轉(zhuǎn)化體，通過數(shù)字液滴PCR來表征其PSEC拷貝數(shù)（圖1D）。株系3-1和24-1攜帶一個(gè)PSEC轉(zhuǎn)基因拷貝（圖1D），入選特征分析的對象。株系3-1像野生型一樣生長和開花，有正常的雄蕊和花藥。經(jīng)過KI/I2染色，株系3-1的雄蕊比野生型的雄蕊顏色淺，近一半的3-1單株花粉粒缺乏紫色的染色（圖1E）。這些觀察結(jié)果與研究團(tuán)隊(duì)以前的研究是一致的。
存活的花粉占所有3-1株系花粉的一半，如卡方檢驗(yàn)所示（χ2 < χ20.05,1；圖1F），符合PSEC單拷貝的預(yù)期分離率。為了確認(rèn)PSEC的存在與否，研究團(tuán)隊(duì)仔細(xì)地在體視顯微鏡下從株系3-1中采集了大約100個(gè)染色的花粉和100個(gè)未染色的花粉，并進(jìn)行基因組DNA提取和Cas9 PCR擴(kuò)增，三次重復(fù)。所有紫色花粉都缺乏PSEC，而所有未染色的花粉都含有PSEC轉(zhuǎn)基因（圖1G）。
研究團(tuán)隊(duì)對株系3-1、3-4和3-7的自交后代進(jìn)行基因型鑒定，通過Sanger測序確定目標(biāo)突變，鑒定到Cas9陰性植物中ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6的所有可能的純合單、雙、三突變組合。這套完整的Zmgrf1、Zmgrf5和Zmgrf6突變體可同時(shí)用于基因功能研究和育種（圖1H），所有突變體都比WT短（圖1H）。株系3-1-16、3-1-56和3-1-156三個(gè)突變體可能不會(huì)產(chǎn)生基因剔除（KO），而可能產(chǎn)生弱等位基因。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對上述確認(rèn)的KO突變的后代進(jìn)行基因型鑒定和特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其保留的PSEC的高突變活性。
為了研究PSEC轉(zhuǎn)基因如何傳播和遺傳，研究團(tuán)隊(duì)用PSEC轉(zhuǎn)基因T1作為花粉供體或受體與三個(gè)玉米自交系JD96M、D96F和B73雜交（圖1I）。當(dāng)使用株系3-2、3-3、3-6作為花粉供體時(shí)，通過PCR對JD96M×3-2、JD96F×3-3和B73×3-6雜交產(chǎn)生的272、357和272個(gè)F1種子進(jìn)行Cas9的基因型鑒定。結(jié)果顯示，沒有一個(gè)種子攜帶Cas9基因，表明PSEC不能通過3-2、3-3和3-6花粉傳播和遺傳。相反，3-2×D96M、3-3×JD96F和3-6×B73雜交產(chǎn)生的所有F1種子中約有一半檢測到PSEC。這些數(shù)據(jù)與PSEC只能通過雌配子體傳播和遺傳的預(yù)期相一致。
為了測試可遺傳的PSEC轉(zhuǎn)基因是否表現(xiàn)出有效的靶向突變活性，研究團(tuán)隊(duì)用株系3-1作為雌性親本，對上述每個(gè)雜交的40個(gè)F1種子進(jìn)行基因型鑒定。在所有F1種子中，17.5-95%單株在ZmGRF1、ZmGRF5和/或ZmGRF6的每個(gè)靶點(diǎn)上都有所需的純合/雙等位突變（圖1I）。這些數(shù)據(jù)表明，所需的突變可以通過以PSEC為母本的雜交有效產(chǎn)生。
總之，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種既沒有花粉擴(kuò)散轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)，又能保持基因編輯元件穩(wěn)定遺傳，且保持高編輯活性的技術(shù)的基因編輯技術(shù)，該技術(shù)適用于CRISPR/Cas9之外的其它CRISPR/Cas技術(shù)；研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)還創(chuàng)制了靶向ZmGRF獲得特定品種系列矮桿同型衍生品種技術(shù)，為矮桿育種提供了新的技術(shù)策略和解決方案，具有種業(yè)應(yīng)用潛力與價(jià)值。
北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心是由北大荒墾豐種業(yè)股份有限公司和上海澤泉科技股份有限公司共同建設(shè)的開放式高通量植物基因型-表型-育種服務(wù)平臺(tái)。中心建立了基因克隆和載體平臺(tái)、作物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)、基因型分析平臺(tái)、表型鑒定分析平臺(tái)、數(shù)據(jù)分析和利用平臺(tái)等現(xiàn)代化生物技術(shù)和信息支持平臺(tái)，是定位于為植物科研和作物育種提供植物基因型-表型-育種數(shù)據(jù)分析的科研服務(wù)平臺(tái)。
基因編輯服務(wù)+靶向測序服務(wù)方案
為了縮短您的育種進(jìn)程，提高您的育種成功率，北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心將為您提供水稻基因編輯服務(wù)。本方案利用基因編輯酶系統(tǒng)編輯供試材料的目的基因，在不改變其他基因的情況下迅速獲取一批目的基因缺失型突變體。解決傳統(tǒng)雜交選育中存在的周期長，基因連鎖等難題。
技術(shù)路線：
靶向測序服務(wù)
靶向測序技術(shù)主要分為基于多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)（GenoPlexs）和基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術(shù)（GenoBaits）兩種�？赏瓿蓡螛悠�50-5000和3000-40000標(biāo)記的基因型分析，并達(dá)到可設(shè)計(jì)區(qū)域覆蓋度高于95%，擴(kuò)增子均一性高于90%的捕獲效率。
應(yīng)用領(lǐng)域：
如您需要了解更多信息，請識(shí)別下方二維碼填寫登記表，我們會(huì)為您提供專業(yè)的服務(wù)，真誠期待與您的合作！
CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)具有靶向精準(zhǔn)、操作簡便、突變類型豐富、應(yīng)用范圍廣、效率高等突出優(yōu)勢，已成為農(nóng)作物遺傳改良的主要技術(shù)工具。當(dāng)前，通過穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化CRISPR/Cas是植物基因編輯的主要途徑。然而，有性繁殖植物中，轉(zhuǎn)基因元件可通過植物的花粉向自然與農(nóng)業(yè)環(huán)境中擴(kuò)散傳播。玉米是典型的異交授粉植物，一個(gè)單株可產(chǎn)生200萬至500萬�；ǚ�，可能帶來非預(yù)期的生物安全管理風(fēng)險(xiǎn)。前人已報(bào)道了一種“自殺式”轉(zhuǎn)基因策略，可以產(chǎn)生無轉(zhuǎn)基因的基因編輯植物以解決轉(zhuǎn)基因擴(kuò)散問題，對無性繁殖植物因無減數(shù)分裂重組以去除轉(zhuǎn)基因成分，該方法也是理想的生物安全管理解決方案。然而，有多個(gè)基因編輯生物育種技術(shù)場景仍需活體中保持CRISPR/Cas存在，持續(xù)發(fā)生基因編輯靶向突變活性。因此，研發(fā)一種既沒有花粉擴(kuò)散轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)，又能保持基因編輯元件穩(wěn)定遺傳，且保持高編輯活性的技術(shù)，尤為必要。此外，玉米是世界上主要的糧食作物，緊湊矮桿等耐密株型遺傳改良是當(dāng)代玉米遺傳與育種主要方向，降低株高具有抗倒、增密增產(chǎn)等農(nóng)學(xué)意義。以某個(gè)特定的品種為“底盤”，創(chuàng)制系列降低株高同型衍生品種，對擴(kuò)大該品種適應(yīng)生態(tài)區(qū)域與生產(chǎn)應(yīng)用推廣，具有重要價(jià)值。
近日，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作科所及西北農(nóng)林科技大學(xué)的聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)在《Plant Communications》在線發(fā)表了題為“Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize”的研究論文，介紹了研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種花粉自清除CRISPR/Cas (PSEC)靶向多個(gè)生長調(diào)節(jié)因子-GRF，通過引入花粉特異表達(dá)的能量耗竭元件，成功實(shí)現(xiàn)了含有PSEC元件的單倍體花粉不育，導(dǎo)致玉米植株世代穩(wěn)定維持PSEC元件半合子雜合體，PSEC僅能通過雌性配子體向下一代遺傳。同時(shí)，利用玉米植株中PSEC可跨世代保持高效的靶向ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6基因編輯活性，基于同一個(gè)材料創(chuàng)制出系列株高版本的同型衍生品系。
為了開發(fā)程序化的PSEC系統(tǒng)，研究團(tuán)隊(duì)在CRISPR/Cas9載體T-DNA中引入了一個(gè)雄性配子體失活基因，即玉米α-淀粉酶基因ZmAA1，該基因由一個(gè)花粉特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（Polygalacturonase 47, ZmPG47）（圖1A）。含有PSEC轉(zhuǎn)基因的花粉是不能存活的，但PSEC轉(zhuǎn)基因可以通過雌配子體遺傳給下一代（圖1B）。與受體材料雜交時(shí)，PSEC的Cas編輯活性被保留下來，并能產(chǎn)生新的等位基因靶向突變（圖1C）。同時(shí)，研究團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了PSEC來靶向編碼三種生長調(diào)節(jié)因子的基因，即ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6，并獲得了單一或多個(gè)突變體（圖1A）。
圖1花粉自清除CRISPR/Cas9（PSEC）消除含有轉(zhuǎn)基因的花粉并保留目標(biāo)突變
研究團(tuán)隊(duì)利用PSEC針對玉米自交系ZC01的未成熟胚胎進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，結(jié)果分離出25個(gè)獨(dú)立的T0轉(zhuǎn)化體。在對目標(biāo)突變進(jìn)行初步評(píng)估后，研究團(tuán)隊(duì)選擇了5個(gè)轉(zhuǎn)化體，通過數(shù)字液滴PCR來表征其PSEC拷貝數(shù)（圖1D）。株系3-1和24-1攜帶一個(gè)PSEC轉(zhuǎn)基因拷貝（圖1D），入選特征分析的對象。株系3-1像野生型一樣生長和開花，有正常的雄蕊和花藥。經(jīng)過KI/I2染色，株系3-1的雄蕊比野生型的雄蕊顏色淺，近一半的3-1單株花粉粒缺乏紫色的染色（圖1E）。這些觀察結(jié)果與研究團(tuán)隊(duì)以前的研究是一致的。
存活的花粉占所有3-1株系花粉的一半，如卡方檢驗(yàn)所示（χ2 < χ20.05,1；圖1F），符合PSEC單拷貝的預(yù)期分離率。為了確認(rèn)PSEC的存在與否，研究團(tuán)隊(duì)仔細(xì)地在體視顯微鏡下從株系3-1中采集了大約100個(gè)染色的花粉和100個(gè)未染色的花粉，并進(jìn)行基因組DNA提取和Cas9 PCR擴(kuò)增，三次重復(fù)。所有紫色花粉都缺乏PSEC，而所有未染色的花粉都含有PSEC轉(zhuǎn)基因（圖1G）。
研究團(tuán)隊(duì)對株系3-1、3-4和3-7的自交后代進(jìn)行基因型鑒定，通過Sanger測序確定目標(biāo)突變，鑒定到Cas9陰性植物中ZmGRF1、ZmGRF5和ZmGRF6的所有可能的純合單、雙、三突變組合。這套完整的Zmgrf1、Zmgrf5和Zmgrf6突變體可同時(shí)用于基因功能研究和育種（圖1H），所有突變體都比WT短（圖1H）。株系3-1-16、3-1-56和3-1-156三個(gè)突變體可能不會(huì)產(chǎn)生基因剔除（KO），而可能產(chǎn)生弱等位基因。研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步對上述確認(rèn)的KO突變的后代進(jìn)行基因型鑒定和特征分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其保留的PSEC的高突變活性。
為了研究PSEC轉(zhuǎn)基因如何傳播和遺傳，研究團(tuán)隊(duì)用PSEC轉(zhuǎn)基因T1作為花粉供體或受體與三個(gè)玉米自交系JD96M、D96F和B73雜交（圖1I）。當(dāng)使用株系3-2、3-3、3-6作為花粉供體時(shí)，通過PCR對JD96M×3-2、JD96F×3-3和B73×3-6雜交產(chǎn)生的272、357和272個(gè)F1種子進(jìn)行Cas9的基因型鑒定。結(jié)果顯示，沒有一個(gè)種子攜帶Cas9基因，表明PSEC不能通過3-2、3-3和3-6花粉傳播和遺傳。相反，3-2×D96M、3-3×JD96F和3-6×B73雜交產(chǎn)生的所有F1種子中約有一半檢測到PSEC。這些數(shù)據(jù)與PSEC只能通過雌配子體傳播和遺傳的預(yù)期相一致。
為了測試可遺傳的PSEC轉(zhuǎn)基因是否表現(xiàn)出有效的靶向突變活性，研究團(tuán)隊(duì)用株系3-1作為雌性親本，對上述每個(gè)雜交的40個(gè)F1種子進(jìn)行基因型鑒定。在所有F1種子中，17.5-95%單株在ZmGRF1、ZmGRF5和/或ZmGRF6的每個(gè)靶點(diǎn)上都有所需的純合/雙等位突變（圖1I）。這些數(shù)據(jù)表明，所需的突變可以通過以PSEC為母本的雜交有效產(chǎn)生。
總之，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種既沒有花粉擴(kuò)散轉(zhuǎn)基因風(fēng)險(xiǎn)，又能保持基因編輯元件穩(wěn)定遺傳，且保持高編輯活性的技術(shù)的基因編輯技術(shù)，該技術(shù)適用于CRISPR/Cas9之外的其它CRISPR/Cas技術(shù)；研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)還創(chuàng)制了靶向ZmGRF獲得特定品種系列矮桿同型衍生品種技術(shù)，為矮桿育種提供了新的技術(shù)策略和解決方案，具有種業(yè)應(yīng)用潛力與價(jià)值。
—— 參考文獻(xiàn) ——
Wang, H., Qi, X., Zhu, J., et al. Pollen self-elimination CRISPR/Cas genome editing prevents transgenic pollen dispersal in maize[J]. Plant Communications, 2023, 100637.
基因編輯服務(wù)+靶向測序服務(wù)方案
為了縮短您的育種進(jìn)程，提高您的育種成功率，北大荒墾豐種業(yè)-澤泉科技生物技術(shù)與表型服務(wù)中心將為您提供水稻基因編輯服務(wù)。本方案利用基因編輯酶系統(tǒng)編輯供試材料的目的基因，在不改變其他基因的情況下迅速獲取一批目的基因缺失型突變體。解決傳統(tǒng)雜交選育中存在的周期長，基因連鎖等難題。
技術(shù)路線：
靶向測序服務(wù)
靶向測序技術(shù)主要分為基于多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)（GenoPlexs）和基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術(shù)（GenoBaits）兩種�？赏瓿蓡螛悠�50-5000和3000-40000標(biāo)記的基因型分析，并達(dá)到可設(shè)計(jì)區(qū)域覆蓋度高于95%，擴(kuò)增子均一性高于90%的捕獲效率。
GenoPlex基于多重PCR的靶向基因捕獲技術(shù)方案
GenoBaits基于液相探針雜交的靶向基因捕獲技術(shù)方案
應(yīng)用領(lǐng)域：
| 種質(zhì)資源分析 | 分子標(biāo)記輔助選擇 |
| 分子標(biāo)記輔助回交改良 | 全基因組選擇 |
| 全基因組關(guān)聯(lián)分析 | 遺傳圖譜構(gòu)建 |
| QTL定位 |
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郵箱：sales@zealquest.com
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