細(xì)菌性腸道發(fā)酵綜合征的菌群特征、動態(tài)變化以及治療效果探究

自動釀酒綜合征(Auto-brewery syndrome ,ABS)，也被稱為腸道發(fā)酵綜合征，是指病人在攝入無酒精高碳水化合物飲食后產(chǎn)生醉酒的狀況。首個ABS病例報道于1894年的法國，此后不斷有ABS患者被發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)認(rèn)為其中相關(guān)微生物主要為真菌Candida spp.（念珠菌屬）和Saccharomyces spp.（酵母菌屬）。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，正常情況下，細(xì)胞代謝會產(chǎn)生少量內(nèi)源性乙醇作為中間體或產(chǎn)物。在結(jié)腸的厭氧條件下，碳水化合物衍生的丙酮酸可以被代謝成乙醛，然后乙醛被還原成乙醇。這一過程有利于腸道細(xì)菌或酵母的過度生長和碳水化合物的過度消耗，由此產(chǎn)生的內(nèi)源性乙醇被腸道和肝臟酒精脫氫酶(Adh)、過氧化氫酶和微粒體乙醇氧化系統(tǒng)迅速且?guī)缀跬耆�地從血液中清除。然而，�?dāng)內(nèi)源性乙醇超過腸道和肝臟的代謝能力時，就會在體內(nèi)積累，導(dǎo)致血液酒精濃度(BAC)升高，進(jìn)而發(fā)生ABS。

2023年4月，首都兒科研究所的袁靜研究員、北京微生物流行病研究所的楊瑞馥教授、北京朝陽醫(yī)院的王晶教授及團(tuán)隊在eBioMedicine（IF=11.1）期刊發(fā)表一項題為“Three Klebsiella species as potential pathobionts generating endogenous ethanol in a clinical cohort of patients with autobrewery syndrome: a case control study”的病例對照研究，通過多組學(xué)分析ABS患者腸道菌群特征及其與患者血液乙醇濃度的動態(tài)變化，證實(shí)克雷伯菌屬產(chǎn)生的過量內(nèi)源性乙醇是導(dǎo)致細(xì)菌性ABS的主要病因，聯(lián)合使用抗生素、復(fù)方益生菌制劑及低碳水化合物飲食的治療策略可有效緩解ABS。（麥特繪譜提供非靶向代謝組學(xué)檢測分析）

研究團(tuán)隊此前報道一例抗真菌治療無效的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)伴ABS的患者，并從患者中分離到高產(chǎn)酒精(HiAlc)的肺炎克雷伯菌，研究人員推斷HiAlc肺炎克雷伯菌是細(xì)菌性ABS的致病因子，靶向腸道菌群針對性使用抗生素可有效控制真菌治療無效的ABS患者的臨床癥狀。本研究通過臨床隊列研究驗證該菌在ABS的發(fā)生和發(fā)展中的作用機(jī)制。

腸道菌群及代謝組學(xué)分析

本研究納入5名ABS患者和5名健康對照（HC）。糞便宏基因組學(xué)分析顯示，與HC組比，ABS患者的腸道菌群失調(diào)，厚壁菌門豐度降低，變形菌門豐度增加，其中克雷伯菌屬的豐度與患者血液中的乙醇濃度波動密切相關(guān)。非靶向代謝組學(xué)分析（麥特繪譜提供服務(wù)）篩選到77種差異代謝物，其中許多神經(jīng)遞質(zhì)和特定代謝物（如γ-氨基丁酸、多巴、5-羥多巴胺、2,3-丁二醇、鵝去氧膽酸、酪氨酸、苯丙氨酸、苯甲醇、色氨酸和腐胺）在ABS發(fā)作時顯著增加；相反，血清素和石膽酸的豐度降低。這些結(jié)果表明，神經(jīng)遞質(zhì)類物質(zhì)通過腸-腦軸介導(dǎo)的患者情緒發(fā)生變化類似于酒精中毒。

圖1. ABS患者與健康對照的腸道菌群和代謝物比較分析

腸道菌群與BAC的動態(tài)變化及相關(guān)性

收集發(fā)病次數(shù)最多的ABS-2患者在不同時期（特別是治療期間）的樣本進(jìn)行血液酒精濃度監(jiān)測和糞便宏基因組學(xué)分析，結(jié)果顯示，該患者每次發(fā)病時的BAC達(dá)到300-400mg/dL(65 mmol/L- 87 mmol/L，相當(dāng)于15杯酒精含量為40%的威士忌)。通過飲食控制和益生菌干預(yù)措施后，該患者前期暫時性改善，隨后逐漸恢復(fù)原狀。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)腸桿菌科的5個菌屬的分布與BAC波動密切相關(guān)，包括克雷伯菌、大腸桿菌、志賀氏桿菌、沙門氏菌和腸桿菌，當(dāng)BAC 在發(fā)病狀態(tài) (S2) 期間達(dá)到 400 mg/dL時，幾乎是發(fā)病前樣本或健康對照樣本的60倍。隨后對糞便樣本分離到的5種菌屬的細(xì)菌進(jìn)行產(chǎn)乙醇能力檢測，發(fā)現(xiàn)HiAlc克雷伯菌屬的產(chǎn)乙醇能力最高，說明克雷伯菌可能是ABS的潛在致病因素。

圖2. 患者腸道菌群與血液酒精濃度的相關(guān)性

體內(nèi)體外實(shí)驗證實(shí)HiAlc克雷伯菌通過產(chǎn)生內(nèi)源性乙醇促進(jìn)ABS的發(fā)生

首先通過發(fā)酵培養(yǎng)檢測ABS患者腸道不同部位灌洗液的乙醇濃度，結(jié)果顯示在腸道灌洗液中檢測到高濃度乙醇，同時存在克雷伯菌，其在高濃度酒精的部位豐度更高。進(jìn)一步從ABS-2患者的小腸、結(jié)腸和糞便中分離出 17 株 HiAlc 克雷伯菌，選取產(chǎn)酒精能力最強(qiáng)的三種菌株進(jìn)行生理特性分析，發(fā)現(xiàn)這些菌株具有透明的莢膜、較強(qiáng)的生物膜形成能力，以及更快的生長速度。培養(yǎng)實(shí)驗表明，這些菌株的產(chǎn)乙醇能力與碳源和環(huán)境氧氣條件有關(guān)。

隨后建立了家兔腸道培養(yǎng)模型以驗證HiAlc克雷伯菌在體內(nèi)能否產(chǎn)生酒精。結(jié)果顯示，在每個菌株培養(yǎng)4小時后，家兔腸道內(nèi)、結(jié)腸粘液和體外培養(yǎng)的乙醇濃度相當(dāng)，與標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC 2146相比，所有三株HiAlc克雷伯菌在體內(nèi)都具有較強(qiáng)的產(chǎn)乙醇能力。進(jìn)而一步構(gòu)建小鼠模型證實(shí)HiAlc克雷伯菌在體內(nèi)可產(chǎn)生大量內(nèi)源性乙醇來誘導(dǎo)ABS發(fā)生，表明該菌是ABS發(fā)作的重要致病菌。

圖3. ABS患者腸道不同部位的產(chǎn)乙醇能力及分離出的HiAlc克雷伯菌的特征

誘導(dǎo)HiAlc克雷伯氏菌產(chǎn)生酒精的膳食成分的鑒定

將5名ABS患者發(fā)病及恢復(fù)期和5名HC的糞便樣本在含有不同濃度碳水化合物或蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在含有不同單糖培養(yǎng)基中，ABS患者發(fā)病期的糞便菌群可產(chǎn)生高達(dá) 35 mmol/L 的乙醇，而在用含有其他底物的培養(yǎng)基培養(yǎng)的同樣菌群時，酒精濃度要低得多（<10 mmol/L）。此外，ABS 患者恢復(fù)期以及HC組糞便菌群產(chǎn)乙醇濃度較低。這些結(jié)果表明單糖可以快速誘導(dǎo)HiAlc 克雷伯菌發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，是ABS發(fā)作的重要食物誘因。

圖4. 不同膳食成分誘導(dǎo)因素評估

靶向腸道菌群治療的臨床驗證

最后以ABS-2患者為例分析腸道菌群對不同抗生素的敏感性，其中左氧氟沙星和亞胺培南的使用顯著降低了腸道菌群的產(chǎn)酒能力，并且這兩種抗生素存在時，發(fā)酵的主要副產(chǎn)物短鏈脂肪酸（例如乙酸、丙酸、丁酸和戊酸）也顯著減少，克雷伯菌豐度顯著降低�；�于此，對ABS-2患者進(jìn)行微生物群相關(guān)治療：補(bǔ)充15%氨基酸和維生素C注射液(250 mL/天)3天后，患者飲食被限制為無糖和無碳水化合物，在醫(yī)院口服抗生素(左氧氟沙星500 mg/天)治療1周后，患者中毒癥狀逐漸消退。隨后根據(jù)患者與健康對照者之間差異菌群，使用益生菌進(jìn)行腸道菌群重建，益生菌為含有26種乳酸桿菌的商業(yè)復(fù)合益生菌和一種含有丁酸梭菌和芽孢桿菌的益生菌。期間患者BAC在0-13 mmol/L持續(xù)波動并最終降至0 mmol/L，同時，克雷伯菌的拷貝數(shù)也顯著降低。

圖5. 抗生素治療對腸道菌群的作用

小結(jié)

綜上，本研究報道了細(xì)菌性ABS的腸道菌群特征、動態(tài)變化以及治療效果。研究結(jié)果證實(shí)，一些腸道細(xì)菌通過產(chǎn)生大量內(nèi)源性酒精而過度生長導(dǎo)致ABS的發(fā)生。使用適當(dāng)?shù)目股�素加上�?fù)雜的益生菌制劑和控制飲食能夠有效治療細(xì)菌性ABS。此外，內(nèi)源性乙醇的產(chǎn)生不僅對ABS很重要，而且對NASH和許多其他疾病也很重要。本研究的方法將有助于臨床醫(yī)生對ABS進(jìn)行精確診斷，并為ABS的替代治療策略的研究提供新的途徑。

圖6. 細(xì)菌性ABS的產(chǎn)生機(jī)制
 

客戶案例原文

Xue G, et al. Three Klebsiella species as potential pathobionts generating endogenous ethanol in a clinical cohort of patients with auto-brewery syndrome: a case control study. EBioMedicine. 2023.

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