NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)應(yīng)用于CAR-T細(xì)胞治療

嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）指的是嵌合抗原受體T細(xì)胞通過識(shí)別某種腫瘤抗原的抗體的抗原結(jié)合部與CD3-δ鏈或FcεRIγ的胞內(nèi)部分在體外偶聯(lián)為一個(gè)嵌合蛋白，通過基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染患者的T細(xì)胞，使其表達(dá)嵌合抗原受體，使得患者的T細(xì)胞被“重編碼”后，能夠生成大量腫瘤特異性的CAR-T細(xì)胞。把重新編碼后的嵌合抗原受體T細(xì)胞加進(jìn)患者身體里，這種嵌合抗原受體就像GPS一樣可以特異性地追蹤和識(shí)別并引導(dǎo)T細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。以CAR為基礎(chǔ)的細(xì)胞免疫治療是一種新的治療惡性腫瘤的模式，越來越多的臨床試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了CAR-T細(xì)胞免疫治療的效力, 特別是血液病方面, 如白血病, 淋巴瘤。當(dāng)然，在實(shí)體瘤的治療方面仍需要不斷努力。
 

2017年日本福岡大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)者 Hirotomo Shibaguchi，Naixiang  Luo，Naoto Shirasu 等發(fā)表 OncoTargets and Therapy 文章Enhancement of antitumor activity by using a fully human gene encoding a single-chain fragmented antibody specific for carcinoembryonic antigen，使用NEPA21進(jìn)行電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)。
 

文中研究表明，為了增強(qiáng)免疫細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境下的抗腫瘤活性，研究者使用表達(dá)CAR的淋巴細(xì)胞結(jié)合IL-2融合蛋白，該融合蛋白含有針對(duì)癌胚抗原的單鏈片段抗體(scFv)。通過一系列對(duì)CAR進(jìn)行改造，使其最有效地激活并表達(dá)INF-γ（腫瘤壞死因子）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CAR導(dǎo)向的外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）與含IL-2形成的融合蛋白的聯(lián)合治療應(yīng)用，對(duì)MKN-45的抗腫瘤活性效果顯著增強(qiáng)。

這種新型的CAR 與由功能性細(xì)胞因子和全人類單鏈抗體組成的融合蛋白的聯(lián)合治療將可能是一種很有前途的癌癥免疫治療方法。
 

本實(shí)驗(yàn)中研究者們使用了：

NEPA21 電轉(zhuǎn)系統(tǒng)
 

文章對(duì)比了不同電轉(zhuǎn)方式，推薦使用NEPA21 電轉(zhuǎn)系統(tǒng)，轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞存活率好。

文中表明，“使用原代細(xì)胞核酸轉(zhuǎn)染儀(Lonza Group Ltd, Basel, Switzerland)轉(zhuǎn)染T細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%，但遺憾的是，在其實(shí)驗(yàn)中，培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞存活率為低于50％。由于我們使用原代細(xì)胞來評(píng)估單鏈抗體在CAR和融合蛋白中的聯(lián)合抗癌作用，因此在基因轉(zhuǎn)染后提高細(xì)胞存活率非常重要。”

“我們比較了2種電穿孔系統(tǒng)，即Nucleofector和NEPA21，其轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞存活率：NEPA21在人T細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效率較高。因此，我們決定使用NEPA21轉(zhuǎn)染hCR-2基因到PBMCs。（表S 1）”
 

“通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)EGFP的表達(dá)，在電穿孔后24小時(shí)，NEPA21轉(zhuǎn)染后PBMCs中hCR-2的表達(dá)率約為60％，細(xì)胞存活率高達(dá)95%。”
 

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NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞、受精卵、活體動(dòng)物及離體組織器官的高效轉(zhuǎn)染，包括鼠、兔、魚、爪蟾\蝌蚪、蜜蜂、蟋蟀、蠶、水蚤、渦蟲等各種活體及受精卵胚胎的轉(zhuǎn)染，還可以用于植物種子、微藻等的電轉(zhuǎn)化。配合獨(dú)有的電壓衰減（Voltage Decay）設(shè)計(jì)，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)，提高細(xì)胞存活率。

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1、

2、
 

3、Du SH, Li Z, Chen C, Tan WK, Chi Z, Kwang TW, Xu XH, Wang S
Co-Expansion of Cytokine-Induced Killer Cells and Vγ9Vδ2 T Cells for CAR T-Cell Therapy.

4、Shibaguchi H, Luo N, Shirasu N, Kuroki M, Kuroki M
Enhancement of antitumor activity by using a fully human gene encoding a single-chain fragmented antibody specific for carcinoembryonic antigen.