利用近紅外區(qū)造影劑和OCT技術(shù)：揭示腫瘤內(nèi)部和腫瘤邊緣淋巴引流

多路徑體內(nèi)成像對(duì)于同時(shí)標(biāo)記不同的分子生物標(biāo)志物是非常理想的，能夠跟蹤多個(gè)細(xì)胞的遷移和體內(nèi)多種分子的運(yùn)動(dòng)。通過利用熒光標(biāo)記技術(shù)，活體顯微鏡(IVM)可以在活體動(dòng)物中同時(shí)觀察多種細(xì)胞或分子的活動(dòng)。然而，即使使用最先進(jìn)的多光子顯微鏡，IVM的組織穿透也高達(dá)400 μ m，難以應(yīng)用到許多臨床前和臨床研究。光學(xué)相干斷層掃描(OCT)是一種新興的成像方式，允許組織穿透達(dá)幾毫米，同時(shí)在活體中保持高空間分辨率。然而，由于大多數(shù)生物、細(xì)胞和生物分子缺乏固有的OCT對(duì)比度，傳統(tǒng)的無標(biāo)簽OCT僅通過檢測(cè)成像組織的背散射光來顯示組織解剖結(jié)構(gòu)。越來越需要開發(fā)合適的OCT造影劑，來擴(kuò)大OCT在細(xì)胞和分子成像方面的應(yīng)用，特別是通過多重造影劑的方式。到目前為止，已經(jīng)研究了相當(dāng)多的材料作為外源性O(shè)CT造影劑，包括微球、微泡、磁性納米顆粒和等離子體納米顆粒。已有研究證明在近紅外一區(qū)（NIR-I）使用造影劑進(jìn)行多重成像的潛力，但由于NIR-I光線穿透率低等。在這項(xiàng)工作中，研究者展示了一類新的OCT金納米造影劑(GNBPs)，具有更窄的等離子體共振峰和更高的光譜靈敏度。通過合成具有不同寬高比和共振峰的GNBP，可以同一動(dòng)物體內(nèi)同時(shí)顯示多個(gè)獨(dú)立淋巴液的流動(dòng)。在黑色素瘤小鼠中，使用GNBPs能夠在體內(nèi)觀測(cè)到腫瘤內(nèi)部和腫瘤邊緣的淋巴流動(dòng)，為研究腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移提供了重要依據(jù)。

GNBP-I和GNBP-II在體外OCT信號(hào)對(duì)比

使用透射電鏡合成了具有相似的表面形態(tài)但尺寸和縱橫比不同的GNBP-I和GNBP-II造影劑，NIR光譜顯示他們的共振峰分別為1225nm和1415nm。使用將帶寬內(nèi)的OCT干涉圖劃分為兩個(gè)子帶的雙波段光譜分析來檢測(cè)：波段I(1250-1320nm)和波段II(1321-1400nm)。每個(gè)子帶的干涉圖被獨(dú)立重建，在光譜域產(chǎn)生兩幅OCT圖像。然后將波段II OCT圖像與波段I OCT圖像相減，得到光譜對(duì)比信號(hào)。為了測(cè)量光譜對(duì)比信號(hào)強(qiáng)度作為每種GNBP濃度的函數(shù)，使用小鼠全血作為參考，在毛細(xì)管中以梯度濃度對(duì)GNBP-I和GNBP-II進(jìn)行成像。在重建的光譜OCT b掃描圖像中觀察到水和血液中GNBP-I和GNBP-II的兩種不同的光譜對(duì)比信號(hào)，采用色調(diào)飽和度值(HSV)方案進(jìn)行彩色編碼。GNBP-I表現(xiàn)出正的光譜對(duì)比信號(hào)，因?yàn)樗�增�?qiáng)了波段I的散射，但降低了波段II的散射。由于GNBP-II對(duì)兩個(gè)子波段的響應(yīng)相反，因此顯示出負(fù)的光譜對(duì)比信號(hào)，但其在波段II的散射比波段I更強(qiáng)。采用離散偶極近似方法模擬了兩種GNBP的散射曲線。隨著濃度的增加，兩種GNBP的OCT光譜對(duì)比信號(hào)都更強(qiáng)。分析還表明，GNBP-I的光譜對(duì)比信號(hào)在5 pM至1 nM范圍內(nèi)隨納米顆粒濃度成比例增加，而GNBP-II的光譜對(duì)比信號(hào)在5 ~ 100 pM范圍內(nèi)呈線性增加。當(dāng)納米顆粒濃度超過500 pM時(shí)，可以觀察到GNBP-II的光譜對(duì)比信號(hào)飽和，計(jì)算出GNBP-I和GNBP-II的檢出限分別為3.6和2.8 pM。

GNBP-I和GNBP-II和體內(nèi)OCT信號(hào)隨濃度呈線性相關(guān)

在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，用聚乙二醇(PEG, MW 5 kDa)對(duì)GNBP進(jìn)行偶聯(lián)，以提高其在生物組織中的穩(wěn)定性和生物相容性。為了驗(yàn)證GNBP在體內(nèi)的OCT光譜對(duì)比信號(hào)，使用兩只不同的小鼠耳中皮下注射不同濃度的PEG-GNBP-I和PEG-GNBP-II，并在每次給藥后立即在每個(gè)注射部位用OCT對(duì)組織進(jìn)行成像。為了避免不同注射劑之間的影響，每次注射的體積很小(0.1 μ L)。此外，為防止局部注射的GNBP在成像過程中擴(kuò)散到鄰近的注射部位,注射距離至少分開1mm。不注射GNBP的小鼠耳組織作為對(duì)照，計(jì)算GNBP在組織中流動(dòng)的光譜對(duì)比信號(hào)，在HSV方案中結(jié)合OCT結(jié)構(gòu)、光譜對(duì)比和血流信息創(chuàng)建了橫截面復(fù)合圖像。隨著注射濃度的增加，兩種GNBP在小鼠耳組織中可以觀察到更強(qiáng)的OCT光譜對(duì)比信號(hào)。當(dāng)GNBP-I濃度為5-50 pM，GNBP-II濃度為5-100 pM時(shí)，小鼠耳OCT光譜對(duì)比信號(hào)呈線性增加。

GNBP-I和GNBP-II能同時(shí)顯示體內(nèi)淋巴液的流動(dòng)

使用PEG-GNBP-1和PEG-GNBP-II同時(shí)注射到小鼠耳緣皮下不同位置，在每次注射前后對(duì)小鼠耳朵進(jìn)行OCT掃描并使用雙波段信號(hào)處理法生成具有門控的OCT圖像，以顯示小鼠體內(nèi)血液和淋巴液的光譜對(duì)比。注射造影劑前， OCT光譜圖像只顯示血管網(wǎng)絡(luò)，該圖像中的光譜對(duì)比度信號(hào)接近于零(顏色編碼為青色)由于淋巴液是光學(xué)透明的，因此在流控圖像中沒有信號(hào)。在橫截面復(fù)合圖像中，可以看到一條主血管(紅色箭頭表示)和三條淋巴管(黃色箭頭表示)，淋巴管呈現(xiàn)黑色是因?yàn)榱馨鸵寒a(chǎn)生可忽略的光學(xué)反射。在注射GNBP-I后，觀察到除了血流門控OCT光譜圖像上的血管外，還有一個(gè)廣泛的管狀網(wǎng)絡(luò)，具有高光譜對(duì)比度信號(hào)。由于他們能夠從間質(zhì)組織中排出造影劑，表明這些管狀網(wǎng)絡(luò)可能是淋巴管。橫斷面復(fù)合圖像顯示，所有三條淋巴管均表現(xiàn)出高光譜對(duì)比信號(hào)(箭頭)，證實(shí)了注射后流門控OCT光譜圖像上出現(xiàn)的光譜陽性網(wǎng)絡(luò)確實(shí)是淋巴管。第一次注射后30分鐘，在耳緣另一個(gè)遠(yuǎn)端位置皮下注射第二種造影劑PEG-GNBP-II。第二次注射后，部分淋巴管可見負(fù)的光譜對(duì)比信號(hào)。在橫截面復(fù)合圖像中，可以在其中一個(gè)淋巴管(黃色箭頭)中觀察到負(fù)的光譜對(duì)比信號(hào)。這些連接可能對(duì)應(yīng)于存在于淋巴管室兩端的淋巴閥結(jié)構(gòu)，淋巴管室維持淋巴液的單向流動(dòng)。

GNBP-I和GNBP-II能夠在腫瘤內(nèi)部和腫瘤邊緣分別顯示淋巴流動(dòng)

為了成像腫瘤淋巴引流，先在瘤內(nèi)注射PEG-GNBP-I，然后在腫瘤周圍的組織皮下注射PEG-GNBP-II。注射前OCT血管造影中可以看到血管生成的腫瘤和瘤周血管。瘤內(nèi)注射后，由于GNBP-I在整個(gè)腫瘤內(nèi)擴(kuò)散，整個(gè)腫瘤可見陽性的光譜對(duì)比信號(hào)。從表面流控OCT光譜圖像可以很容易地看到瘤內(nèi)注射造影劑的淋巴引流路徑。不僅腫瘤近側(cè)淋巴管可見陽性光譜對(duì)比信號(hào)，腫瘤遠(yuǎn)側(cè)瘤周淋巴管也可見陽性光譜對(duì)比信號(hào)。與正常淋巴管相比，瘤周淋巴管的平均血管直徑更大，可能是增生造成的。皮下注射PEG-GNBP-II后，觀察到到不僅在瘤周淋巴管，而且在腫瘤內(nèi)部都可以看到陰性的光譜對(duì)比信號(hào)，表明GNBP-II已滲入腫瘤淋巴管。橫斷面復(fù)合圖像顯示，GNBP-II出現(xiàn)在皮膚表面以下50和160 μ m的淺表和深部腫瘤淋巴管中。淺表淋巴管可能與黑色素瘤周圍真皮組織中的淋巴管相對(duì)應(yīng)。然而，位于皮膚表面以下160 μ m的淋巴管對(duì)應(yīng)于腫瘤淋巴管。皮下注射GNBP-II后，腫瘤下游的瘤周淋巴管主要呈現(xiàn)負(fù)的光譜對(duì)比信號(hào)，可能是由于淋巴管清除導(dǎo)致這些淋巴管中GNBP-I的濃度降低。

GNBPs在黑色素瘤小鼠中追蹤前哨淋巴結(jié)

為了進(jìn)一步研究對(duì)比劑注射到兩個(gè)不同盆的淋巴引流路徑，在注射前和每次注射后對(duì)小鼠耳同側(cè)頸深淋巴結(jié)進(jìn)行了成像。注射前橫斷面復(fù)合圖像上未見淋巴結(jié)淋巴管OCT信號(hào)。瘤內(nèi)注射30分鐘后，淋巴結(jié)內(nèi)淋巴管可見陽性光譜對(duì)比信號(hào)。皮下注射30分鐘后，在同一淋巴管中可以觀察到陰性的光譜對(duì)比信號(hào)。結(jié)果表明，在瘤內(nèi)和皮下注射后，GNBPs都被引流到瘤周淋巴管中，然后由頸深淋巴結(jié)收集。在對(duì)植入黑色素瘤的小鼠進(jìn)行體內(nèi)成像后，切除了同側(cè)和對(duì)側(cè)的頸部深部淋巴結(jié)，并進(jìn)行了體外三維(3d)淋巴管造影。在3-D OCT淋巴管光譜圖和橫截面復(fù)合圖像中，同側(cè)頸淋巴結(jié)淋巴管中可見光譜對(duì)比信號(hào)，但在小鼠對(duì)側(cè)淋巴結(jié)中看不到。同側(cè)頸淋巴結(jié)的淋巴管網(wǎng)絡(luò)和淋巴濾泡在三維光譜增強(qiáng)OCT淋巴管造影中清晰可見。結(jié)果表明，使用造影劑GNBPs追蹤了黑色素瘤中的前哨淋巴結(jié)。

綜上，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了光譜可識(shí)別的OCT造影劑- GNBP，并證明了PEG-GNBP可用于活體動(dòng)物NIR-II的多重成像。在淋巴研究領(lǐng)域，該技術(shù)可用于異質(zhì)腫瘤細(xì)胞的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成像，也可用于分子成像研究各種淋巴內(nèi)皮細(xì)胞受體在腫瘤血管生成性淋巴管和淋巴結(jié)中的動(dòng)態(tài)表達(dá)。通過將該技術(shù)應(yīng)用于體內(nèi)腦成像，相信它可以進(jìn)一步揭示在神經(jīng)元炎癥和神經(jīng)退行性疾病中起重要作用的腦淋巴引流通路的奧秘和復(fù)雜性。