構(gòu)建具有可調(diào)熒光的AIE活性超分子籠模塊用于近紅外二區(qū)血管成像

本文要點(diǎn)：熒光超分子籠因其在分子傳感、發(fā)光材料和生物系統(tǒng)中的廣泛應(yīng)用而引起了重大的科學(xué)興趣。然而，構(gòu)建具有可調(diào)發(fā)射行為的這種組裝體，以實(shí)現(xiàn)高性能的生物成像應(yīng)用仍然具有挑戰(zhàn)性。本文中，作者開發(fā)了一種通用且簡(jiǎn)單的方案，通過使用“供體-受體-供體（D-A-D）”加合物作為構(gòu)建塊，來(lái)制定具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光（AIE）傾向的超分子籠。成功制備了一系列可調(diào)熒光從紅色到第二近紅外（NIR-II）區(qū)域的盒狀籠MA-MG。值得注意的是，MG的發(fā)射峰位于981 nm處，表現(xiàn)出迄今為止罕見的NIR-II發(fā)射超分子籠的特性，而籠載納米顆粒MGNPs在NIR-II區(qū)域具有高絕對(duì)量子產(chǎn)率，使其在血管成像中表現(xiàn)良好。

 

 

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熒光超分子籠因其在分子傳感、發(fā)光材料和生物系統(tǒng)中的廣泛應(yīng)用而引起了人們的極大興趣。然而，構(gòu)建可調(diào)節(jié)發(fā)射行為的熒光超分子籠以提供高性能的生物成像仍然極具挑戰(zhàn)性。傳統(tǒng)熒光構(gòu)建塊的主鏈相對(duì)平坦，由于聚集引起的猝滅（aggregation-caused quenching, ACQ）效應(yīng)導(dǎo)致籠在聚集態(tài)或固態(tài)下經(jīng)常觀察到微弱甚至沒有熒光，嚴(yán)重阻礙了它們?cè)诠怆娖骷�和生物系統(tǒng)中的應(yīng)用。而具有聚集誘導(dǎo)發(fā)射（aggregation-induced emission, AIE）性質(zhì)的熒光團(tuán)，在稀溶液中幾乎沒有發(fā)射，但在濃縮或聚集狀態(tài)下顯示出明亮的發(fā)射。顯然，以AIE熒光團(tuán)為構(gòu)建模塊構(gòu)建AIE活性超分子籠對(duì)各種高科技創(chuàng)新具有重要意義。

 

傳統(tǒng)的AIE性質(zhì)的超分子籠大多以四苯乙烯（TPE）衍生物為構(gòu)建模塊，發(fā)射波長(zhǎng)主要位于藍(lán)光或黃光區(qū)域（400-600 nm），組織穿透深度低，在活體生物應(yīng)用方面受到極大的限制；并且傳統(tǒng)的AIE超分子籠仍然缺乏一種通用而簡(jiǎn)單的策略來(lái)微調(diào)節(jié)AIE籠的發(fā)射波長(zhǎng)。

 

本文中開發(fā)了一種新的方案（Scheme 1），通過使用“供體−受體−供體（D-A-D）”加合物制備箱型結(jié)構(gòu)的AIE超分子籠MA-MG。利用電子給體-受體（D-A）相互作用的高強(qiáng)度和可調(diào)節(jié)性，對(duì)配體A-G的電子受體進(jìn)行微調(diào)，實(shí)現(xiàn)了熒光波長(zhǎng)從可見紅光到近紅外二區(qū)（Near-infrared-II, NIR-II）的調(diào)節(jié)，其中MG的最大發(fā)射波長(zhǎng)達(dá)到981nm。并且超分子籠負(fù)載的納米顆粒MGNP在NIR-II區(qū)域具有高達(dá)1.3%絕對(duì)量子產(chǎn)率，在血管成像中表現(xiàn)良好。

方案1.（a）由前體A-G、TPTC和Pt(PEt3)2(OTf)2的自組裝構(gòu)建籠狀物MA-MG的示意圖。（b）由MG制備籠狀物負(fù)載的MGNP及其在活體小鼠血管成像中的應(yīng)用。

 

作者以三苯胺−受體−三苯胺骨架作為構(gòu)建模塊，三苯胺部分用四個(gè)吡啶修飾形成四臂配體，用作電子供體和分子轉(zhuǎn)子，保證了其AIE性質(zhì)。配體A-G通過Suzuki/Still偶聯(lián)反應(yīng)合成，通過提高受體的吸電子能力，A-G表現(xiàn)出逐漸紅移的吸收和熒光。然后利用四吡啶配體A-G、四羧酸配體TPTC和90°Pt受體的配位驅(qū)動(dòng)自組裝制備了超分子籠MA-MG。

 

隨后作者進(jìn)行了多核1H和31P NMR分析、電噴霧電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（ESI-TOF-MS）和X射線衍射來(lái)表征這些籠。如Figure 1a-b所示，籠狀物MA-MG的1H 和31P NMR光譜結(jié)果均符合離散超分子籠的形成。在ESI-TOF-MS光譜中，可觀察到與具有不同電荷態(tài)（6+、5+和4+）的物種相對(duì)應(yīng)的主要峰組，每個(gè)峰的同位素分辨率與模擬模式一致（Figure 1c）。X射線衍射結(jié)果表明ME采用四方棱柱構(gòu)象，類似傾斜的盒形（Figure 1d）。以上的綜合結(jié)果有力地證明了離散多組分超分子籠的成功構(gòu)建。

Figure 1.（a）CD3CN中籠狀MA-MG的部分1H NMR光譜（400 MHz，298 K）。（b）CD3CN中籠狀物MA-MG的31P NMR譜（162MHz，298K）。（c）ME的ESI-TOF-MS光譜。（d）籠ME的頂視圖（左）和前視圖（右）的晶體結(jié)構(gòu)。為清楚起見，省略了抗衡離子和溶劑分子。

 

接著作者進(jìn)行了配體和籠的光物理性質(zhì)研究。發(fā)現(xiàn)與配體A-G相比，MA-MG的吸收峰表現(xiàn)出輕微的藍(lán)移（約5-20 nm），發(fā)射最大波長(zhǎng)則與A-G幾乎相同（Figure 2a-b）。其中MG的發(fā)射最高波長(zhǎng)集中在981nm，相對(duì)量子產(chǎn)率（QY）為2.6%（IR26作為參考，QY=0.5%），是迄今為止罕見的具有NIR-II發(fā)射的超分子籠。盡管不同籠的PL強(qiáng)度比各異，但隨著二甲基亞砜/甲苯混合物中甲苯含量在一定范圍內(nèi)的增加，可觀察到所有分子籠的熒光強(qiáng)度均顯著增強(qiáng)，顯示出顯著的AIE特性（Figure 2c-d）。

Figure 2.（a）籠MA-MG的歸一化吸收光譜及在室內(nèi)燈光下拍攝的照片。（b）籠MA-MG的歸一化發(fā)射光譜。（c）MG在含有不同的甲苯含量（ƒT）的二甲基亞砜/甲苯混合物中的發(fā)射光譜。（d）不同ƒT條件下籠型MA-MG的PL強(qiáng)度變化（I/I0）。

 

籠狀物MA-MG表現(xiàn)出的可調(diào)節(jié)熒光和顯著的AIE性質(zhì)激勵(lì)了作者繼續(xù)研究它們?cè)谏�物成像中的�?yīng)用。作者選擇了在三個(gè)不同區(qū)域（紅色、NIR-I和NIR-II區(qū)域）具有發(fā)射最大值的籠MA、ME和MG，為了使疏水籠在水溶液中具有良好的分散性和穩(wěn)定性，使用兩親性聚合物mPEG-PLGA結(jié)合籠形成納米顆粒（NP）。

 

如Figure3a所示，MANP、MENP和MGNP顯示出單峰峰分布，通過動(dòng)態(tài)光散射（DLS）確定的平均流體動(dòng)力學(xué)直徑分別為55、80和50nm，透射電子顯微鏡（TEM）圖像結(jié)果也與DLS結(jié)果相當(dāng)。MANP、MENP和MGNP的吸收分別顯示出輕微紅移（Figure 3b）；而發(fā)射波長(zhǎng)與CH3CN溶液中的對(duì)應(yīng)物相比藍(lán)移（Figure 3c）。MGNP的相對(duì)QY為6.6%，絕對(duì)QY為1.3%，具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性（Figure 3d-f），這表明MGNP在NIR-II成像中有著巨大潛力。1000、1100、1200nm長(zhǎng)波通（LP）濾光片下，均可觀察到MGNP的明亮發(fā)射，在1000nm LP濾光片下可見MENP的發(fā)射光。MGNP在使用雞胸肉材料的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出高達(dá)6mm的穿透深度，且顯示出濃度依賴性熒光增強(qiáng)（Figure 3g-i）。

Figure 3.（a）DLS結(jié)果及MGNP的TEM圖像。（b）MANP、MENP和MGNP的歸一化吸收光譜。（c）MANP、MENP和MGNP的歸一化發(fā)射光譜。（d）使用IR26作為參考的MG和MGNP（850−1550nm）的相對(duì)量子產(chǎn)率。（e）ICG和MGNP在連續(xù)808nm激光照射（0.8W/cm2）下的吸收強(qiáng)度（A/A0）的變化。（f）使用積分球計(jì)算MANP、MENP和MGNP的絕對(duì)量子產(chǎn)率。（g）MANP、MENP和MGNP的不同LP濾波器下的NIR-II熒光信號(hào)的比較。（h）使用不同厚度的雞胸肉檢測(cè)MGNP（1.5mM）的穿透深度。（i）不同濃度下MGNP的NIR-II熒光信號(hào)的比較。

 

受上述結(jié)果的啟發(fā)，作者繼續(xù)使用MANP、MENP和MGNP進(jìn)行了體內(nèi)生物成像。通過尾靜脈注射MANP和MENP，僅觀察到模糊的圖像，血管和其他組織無(wú)法清晰呈現(xiàn)（Figure 4a）。而小鼠的血管在注射MGNP后立即亮起，整個(gè)血液循環(huán)系統(tǒng)可以清晰可見，可見NIR-II區(qū)間生物成像的優(yōu)越性。同時(shí)，較長(zhǎng)LP濾波器處理的MGNP熒光信號(hào)表現(xiàn)出較高的空間分辨率，使用波長(zhǎng)較長(zhǎng)的濾波器，血管圖像的信噪比（SBR）顯著增加，血管的半峰全寬（FWHM）也變得更窄（Figure 4b）。

Figure 4.（a） MANP、MENP和MGNP在納米顆粒處理5分鐘和1小時(shí)后的體內(nèi)生物成像能力的比較（MANP，激發(fā)波長(zhǎng)Ex: 465nm，發(fā)射波長(zhǎng)Em: 600nm；MENP，Ex: 605nm，Em: 760nm；MGNP，Ex: 808nm，Em: 1300nm LP濾光，曝光時(shí)間300ms）。（b）在不同LP濾光器下用MGNP處理的活體小鼠內(nèi)血管的全身NIR-II熒光成像，以及沿著（b）中的紅色虛線的相應(yīng)橫截面熒光強(qiáng)度分布。下圖中的紅色曲線表示數(shù)據(jù)的高斯擬合。比例尺：1cm。

 

作者還使用不同的LP濾光片研究了MGNP處理的活體小鼠大腦、后肢、爪子和耳朵的血管成像。結(jié)果顯示1300和1400 nm LP濾光片處的熒光信號(hào)也具有最高的SBR和最小的FWHM，與全身成像的結(jié)果一致（Figure 5a-c）。并且小鼠的腦血管系統(tǒng)通過完整的頭皮和頭骨清晰可見，這表明其在監(jiān)測(cè)腦血管疾病方面的應(yīng)用可能性。主要血管的熒光信號(hào)和SBR隨著時(shí)間的推移逐漸減少，肝臟區(qū)域的熒光信號(hào)升高，表明MGNP可能在肝臟代謝（Figure 5d-e）。

Figure 5. 用MGNP處理的活小鼠的NIR-II熒光成像。（a）大腦、（b）后肢和（c）爪子在不同LP濾鏡下的熒光圖像以及帶有紅線的高亮血管的相應(yīng)熒光強(qiáng)度分布（808nm激光照射，1300nm LP濾光，曝光時(shí)間300ms；1400nmLP的500ms曝光時(shí)間）。（a）、（b）和（c）中的比例尺分別為0.5、0.5和0.33cm。（d）注射MGNP后不同時(shí)間點(diǎn)小鼠的熒光圖像。（e）標(biāo)記血管的SBR隨時(shí)間的相應(yīng)變化（808nm激光照射，1300nmLP濾光，曝光時(shí)間300ms）。位置1和2在（d）中用紅線標(biāo)記。比例尺：1cm。

 

最后，作者對(duì)納米顆粒的生物安全性進(jìn)行了系統(tǒng)評(píng)價(jià)。MANP、MENP和MGNP對(duì)正常HUVEC、3T3和HT22細(xì)胞沒有顯示出明顯的細(xì)胞毒性（Figure 6a），低溶血率也表明納米顆粒顯示出良好的血液生物相容性（Figure 6b, e）。主要器官、肝腎功能的蘇木精和伊紅（H&E）染色以及全血細(xì)胞分析的結(jié)果顯示，這些納米顆粒對(duì)正常器官和組織具有較低的系統(tǒng)毒性（Figure 6c-d, f）。

Figure 6.（a）用不同濃度的MGNP孵育24小時(shí)后對(duì)HUVEC、3T3和HT22細(xì)胞的暗毒性。（b）用不同濃度MGNP處理的紅細(xì)胞的相對(duì)溶血率，使用水作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS作為陰性對(duì)照。（c）相關(guān)治療后第10天小鼠的肝功能標(biāo)志物血液生化指標(biāo)。（d）相關(guān)治療后第10天小鼠的腎功能標(biāo)志物血液生化指標(biāo)。（e）使用水作為陽(yáng)性對(duì)照和PBS作為陰性對(duì)照，用不同濃度的MGNP處理的紅細(xì)胞的代表性照片。（f）經(jīng)相關(guān)處理的MGNP小鼠不同器官組織切片的H&E染色圖像。

 

總之，本研究成功地開發(fā)了一種通用而簡(jiǎn)單的策略來(lái)構(gòu)建具有可調(diào)熒光的AIE活性超分子籠，首次構(gòu)建了發(fā)射波長(zhǎng)到達(dá)NIR-II區(qū)域的AIE超分子籠的模塊化，不僅為構(gòu)建熒光超分子籠開辟了一條新的途徑，也將推動(dòng)超分子治療學(xué)的發(fā)展。

 

參考文獻(xiàn)

Qin, Y.; Li, X.; Lu, S.; Kang, M.; Zhang, Z.; Gui, Y.; Li, X.; Wang, D.; Tang, B. Z., Modular Construction of AIE-Active Supramolecular Cages with Tunable Fluorescence for NIR-II Blood Vessel Imaging. ACS Materials Letters 2023, 1982-1991.

 

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