納米抗體的制備

1. 納米抗體的概念：

納米抗體，又稱為駝類單域抗體。是存在于駝類和軟骨魚類中天然存在的僅由兩條重鏈組成的特殊抗體上的重鏈可變區(qū)（VHH, Variable domain of heavy chain antibody）。納米抗體晶體直徑為2.5nm，長約4nm，分子量僅為傳統(tǒng)的完整抗體的1/10（約15kD）但依然具有完整的抗原識別能力，并且可以單獨(dú)穩(wěn)定的在體外存在。

泰克生物建立了一個完善的，成熟的噬菌體抗體展示技術(shù)平臺，提供多種抗體文庫的構(gòu)建服務(wù)（人源scFV抗體文庫構(gòu)建服務(wù)、人源Fab抗體文庫構(gòu)建服務(wù)、羊駝VHH抗體文庫構(gòu)建服務(wù)、人源抗體噬菌體文庫制備服務(wù)、駱駝免疫VHH抗體庫構(gòu)建服務(wù)）和預(yù)制肽文庫/抗體庫篩選服務(wù)。其中，泰克生物從事羊駝VHH抗體制備已有9年多的時間，每年大約完成數(shù)百個羊駝VHH抗體構(gòu)建服務(wù)。

2. 相比于常規(guī)抗體，納米抗體的優(yōu)勢有：

（1）分子量小，易于滲透進(jìn)致密組織甚至是血腦屏障；

（2）親和力高、特異性強(qiáng)、溶解性及穩(wěn)定性好；

（3）人體的免疫原性弱，生物相容性好；

（4）原核或真核系統(tǒng)中高表達(dá)，易于生產(chǎn)；

（5）Nb結(jié)構(gòu)簡單，易于工程化改造。

3. 納米抗體的制備：

圖1：納米抗體的制備流程圖

主要流程：羊駝免疫、噬菌體文庫構(gòu)建、抗體篩選、表達(dá)純化及驗(yàn)證等階段。

1、羊駝經(jīng)過抗原免疫后體內(nèi)產(chǎn)生成熟抗體。

2、采取免疫或未免疫的羊駝外周血液、分離羊駝外周血B淋巴細(xì)胞。

3、提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為底物采用巢氏PCR擴(kuò)增出納米基因的基因片段。

4、然后將擴(kuò)增出的納米抗體的基因片段通過限制性內(nèi)切酶作用連接到噬菌體載體上。

5、將連接產(chǎn)物電轉(zhuǎn)化至感受態(tài)TGl中，構(gòu)建出天然或免疫的羊駝源噬菌體展示納米抗體文庫。

6、通過抗原孵育和ELISA鑒定篩選出所需納米抗體,然后對其進(jìn)行測序。

7、納米抗體表達(dá)純化，納米抗體可在大腸桿菌，酵母或哺乳動物細(xì)胞系里進(jìn)行表達(dá)，因其僅含100多個氨基酸殘基，為驗(yàn)證其是否與抗原結(jié)合，可構(gòu)建質(zhì)粒在大腸桿菌中或酵母菌株中進(jìn)行快速表達(dá)及純化，或者同時在兩種菌株中進(jìn)行表達(dá)純化，驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果。

8、大規(guī)模表達(dá)及純化，納米抗體可由大腸桿菌或酵母中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并在發(fā)酵罐中大規(guī)模表達(dá)，其產(chǎn)量均在g/L以上，故可進(jìn)行量產(chǎn)應(yīng)用于試劑盒檢測，甚至臨床藥物規(guī)�；�量產(chǎn)。