Fab抗體噬菌體展示流程

1. 什么是fab抗體
Fab片段是抗體結(jié)構(gòu)中可以與抗原結(jié)合的區(qū)域，也叫做抗原結(jié)合片段，涉及到抗體-抗原結(jié)合的親和力，抗體特異性等特征。抗體Fab片段含有1個可變區(qū)(V區(qū))和1個恒定區(qū)（C1），V區(qū)含有3個互補(bǔ)決定結(jié)構(gòu)域（CDR），涉及到獨特型抗體的產(chǎn)生，抗體的超頻突變，尤其是CDR3結(jié)構(gòu)域是抗體工程改造的核心區(qū)域；C1區(qū)主要起結(jié)構(gòu)支撐作用。 2. fab抗體文庫優(yōu)點
重組Fab的優(yōu)勢比較明顯，由于不具備Fc區(qū)，從而不需要翻譯后修飾和糖基化，可以同時在原核和哺乳動物系統(tǒng)中表達(dá)。生產(chǎn)Fab片段，通常利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)與哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)成本低、生產(chǎn)速度快等優(yōu)點，但容易形成包涵體，復(fù)性后活性難保證。
3. scfv抗體和fab抗體區(qū)別
4. fab抗體文庫應(yīng)用
Fab類抗體片段具有分子質(zhì)量小、組織分布特異性強(qiáng)、免疫原型低、可基因工程操作等特點，使Fab成為了醫(yī)藥研究領(lǐng)域的重要成員之一，F(xiàn)ab類藥物在預(yù)防、診斷、治療等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，例如：已經(jīng)上市的賽妥珠單抗酯（一種Fab片段，Cat：YR1612），可以有效地針對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；作為Fab片段的美妥昔單抗I也已經(jīng)用于治療肺癌等。
5. 卡梅德生物能夠為客戶提供高質(zhì)量的fab抗體噬菌體展示服務(wù)
卡梅德生物（KMD Bioscience）多年來致力于抗體領(lǐng)域研究。我們積累了豐富的抗體文庫構(gòu)建經(jīng)驗，能夠為客戶提供基于抗體噬菌體展示文庫技術(shù)的fab抗體文庫構(gòu)建服務(wù)。
6. 卡梅德生物為客戶提供fab抗體文庫構(gòu)建服務(wù)的全流程介紹
卡梅德生物為客戶提供fab噬菌體文庫構(gòu)建服務(wù)，流程包括：抗體cDNA制備，基因擴(kuò)增，載體構(gòu)建，電擊轉(zhuǎn)化，抗體鑒定，fab文庫包裝。
6.1 抗體cDNA制備
6.1.1 外周血單核細(xì)胞單克隆化
客戶提供人外周血淋巴細(xì)胞，淋巴結(jié)細(xì)胞或脾臟細(xì)胞（保存在RNA later等溶液中，避免RNA降解，藍(lán)冰運(yùn)輸），EBV病毒單克隆化。
6.1.2 總RNA提取
將外周血淋巴細(xì)胞從冰箱取出后分裝，加入氯仿，離心后取上清加入異丙醇，離心保留沉淀，加入75%乙醇后離心保留沉淀，干燥后加入DEPC水，孵育確保RNA溶解，將各管混合到一管中即為總RNA，取總RNA進(jìn)行電泳，取 總RNA 用核酸濃度測量儀測濃度。
6.1.3 反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA
按照商業(yè)化試劑盒操作說明書進(jìn)行cDNA制備，將上一步得到的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。
6.2 基因擴(kuò)增
以cDNA為模板擴(kuò)增抗體重鏈（Fd段）和輕鏈可變區(qū)基因。
6.3載體構(gòu)建
PCR 擴(kuò)增的 Fd 片段產(chǎn)物（通過瓊脂糖凝膠電泳分離）用過量的限制酶切割，通常約350ng與2μg Xho/Spe I 線性化的 pComb3 載體（通過分離瓊脂糖凝膠電泳）在150μL 的總體積中與連接酶在 16℃下反應(yīng) 15小時，命名為P+Fd。PCR擴(kuò)增的輕鏈片段產(chǎn)物和重組的p+Fd（瓊脂糖凝膠電泳分離）用過量的限制酶切割，連接、轉(zhuǎn)化，將具有Fd和κ輕鏈的噬菌粒命名為pComb3H +κ+ Fd。
6.4電擊轉(zhuǎn)化
6.4.1將連接產(chǎn)物進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化后構(gòu)建含有目的抗體片段的大腸桿菌文庫
取大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，加入回收后的連接產(chǎn)物，將混合后的感受態(tài)細(xì)胞和連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到預(yù)冷好的電轉(zhuǎn)杯中，使用電轉(zhuǎn)儀預(yù)設(shè)的轉(zhuǎn)化程序電擊轉(zhuǎn)化，電轉(zhuǎn)后立即往電轉(zhuǎn)杯中加入培養(yǎng)基，至少進(jìn)行20個電轉(zhuǎn)。將細(xì)胞復(fù)蘇后涂在瓊脂糖培養(yǎng)板上過夜生長。將上一步過夜生長后的培養(yǎng)板上的細(xì)胞用培養(yǎng)基和涂布棒沖洗刮下，加入甘油測OD600nm值后保存在-80℃，即為細(xì)菌文庫。
6.4.2 fab噬菌體文庫篩選
6 孔板（Nunclon™）用等量的外周血淋巴細(xì)胞包被 5×106 個細(xì)胞，然后在4℃下用 BSA/PBS 封閉過夜。每孔加入 1 ml 噬菌體文庫，37℃孵育 2 h。對于第 1、2、3、4 和 5 輪，分別用 TBS/ 吐溫 20 (TBST) 洗滌未結(jié)合的噬菌體 1、5、10、10、10 次。通過添加洗脫緩沖液（0.1 M HCL，用固體甘氨酸調(diào)節(jié)至 pH 2.2 并含有 0.1% BSA）洗脫結(jié)合的噬菌體，并用 2 M Tris 緩沖液，pH 8.0 中和洗脫溶液。如上所述遵循 VCSM13 輔助噬菌體的擴(kuò)增程序，同時在 LB-氨芐青霉素平板上滴定輸入和輸出噬菌體。噬菌體結(jié)合、洗脫和擴(kuò)增步驟進(jìn)行5輪。
6.5抗體鑒定
隨機(jī)挑選20-50個克隆，PCR鑒定陽性率，測序和分析抗體序列。
6.6 fab文庫包裝
交付＞1x1013噬菌體顆粒/ml。
傳統(tǒng)的雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體成本高，而且產(chǎn)生的鼠源抗體往往具有觸發(fā)人抗小鼠抗體（HAMA）反應(yīng)的缺點。因此，通過噬菌體展示技術(shù)產(chǎn)生的重組 Fab 抗體可以成為治療腫瘤的合適替代方案。卡梅德生物為您提供的人源Fab抗體文庫構(gòu)建服務(wù)親和力高，庫容量高，獨立克隆數(shù)107-1012，根據(jù)客戶需求制備，為每一個客戶量身定制實驗方案。