mRNA-LNP（核酸脂質(zhì)納米粒）的構(gòu)效關(guān)系介紹
RNA-LNP常通過(guò)兩相自組裝反應(yīng)進(jìn)行制備，一相為載體脂質(zhì)相，另一相為包含API（活性藥用成分）的水相，制備所需的設(shè)備則是我們已熟知的——微流控設(shè)備。
構(gòu)效關(guān)系，可理解為藥物的理化性質(zhì)與其藥用活性之間的聯(lián)系。功效先行，理論滯后，是社會(huì)中常見(jiàn)的行事邏輯和行為方式，在mRNA-LNP研究領(lǐng)域也不例外，包括已上市的藥物在內(nèi)，其構(gòu)效關(guān)系也未有清晰準(zhǔn)確的闡明。
mRNA-LNP合成過(guò)程所涉及的微觀動(dòng)力學(xué)尚未清楚，而合成后mRNA-LNP表征手段的不足則更為構(gòu)效關(guān)系的探索增添一份難度。諸多的疑問(wèn)等待解答：?jiǎn)蝹�(gè)納米顆粒可以裝載多少mRNA，mRNA-LNP的包封率和空殼率有著怎樣的關(guān)系？后處理過(guò)程會(huì)改變脂質(zhì)的分布嗎？脂質(zhì)本身的分布是怎樣的？如何準(zhǔn)確、定量地表征單個(gè)納米顆粒的組分和載藥量？這些問(wèn)題的解答對(duì)于實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，工藝的優(yōu)化，質(zhì)控的提升，臨床風(fēng)險(xiǎn)的降低有著重要的指導(dǎo)作用。對(duì)于研究者而言，在細(xì)胞/動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，豐富表征手段仍為突破問(wèn)題的核心。
如圖1，mRNA-LNP有各式各樣的結(jié)構(gòu)模型，用一些常見(jiàn)的表征，如粒徑、PDI、包封率檢測(cè)等，很難了解其真實(shí)樣貌。
圖1. mRNA-LNP模型圖
冷凍電鏡（Cryo-EM）
構(gòu)效關(guān)系，可理解為藥物的理化性質(zhì)與其藥用活性之間的聯(lián)系。功效先行，理論滯后，是社會(huì)中常見(jiàn)的行事邏輯和行為方式，在mRNA-LNP研究領(lǐng)域也不例外，包括已上市的藥物在內(nèi)，其構(gòu)效關(guān)系也未有清晰準(zhǔn)確的闡明。
mRNA-LNP合成過(guò)程所涉及的微觀動(dòng)力學(xué)尚未清楚，而合成后mRNA-LNP表征手段的不足則更為構(gòu)效關(guān)系的探索增添一份難度。諸多的疑問(wèn)等待解答：?jiǎn)蝹�(gè)納米顆粒可以裝載多少mRNA，mRNA-LNP的包封率和空殼率有著怎樣的關(guān)系？后處理過(guò)程會(huì)改變脂質(zhì)的分布嗎？脂質(zhì)本身的分布是怎樣的？如何準(zhǔn)確、定量地表征單個(gè)納米顆粒的組分和載藥量？這些問(wèn)題的解答對(duì)于實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)，工藝的優(yōu)化，質(zhì)控的提升，臨床風(fēng)險(xiǎn)的降低有著重要的指導(dǎo)作用。對(duì)于研究者而言，在細(xì)胞/動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，豐富表征手段仍為突破問(wèn)題的核心。
如圖1，mRNA-LNP有各式各樣的結(jié)構(gòu)模型，用一些常見(jiàn)的表征，如粒徑、PDI、包封率檢測(cè)等，很難了解其真實(shí)樣貌。
圖1. mRNA-LNP模型圖
冷凍電鏡（Cryo-EM）
冷凍電鏡適用于觀測(cè)溫度敏感型樣品，是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設(shè)備，以降低電子束對(duì)樣品的損傷，減小樣品的形變，從而得到更加真實(shí)的樣品形貌。
圖2.LNP的Cryo-EM表征
圖2中，A-C直觀展示了納米粒子（復(fù)必泰）的形態(tài)及粒徑分布，也呈現(xiàn)了粒子內(nèi)部的一些模糊形態(tài)；而D則更為清晰的顯示出脂質(zhì)體內(nèi)水相中硫酸多柔比星晶體的棒狀形態(tài)。
小角度X射線散射（SAXS）
多激光圓柱照明共聚焦光譜（CICS）
圖4. LNP的CICS表征
單粒子分析器（SPP）
SAXS是指當(dāng)X射線透過(guò)樣品時(shí)，在靠近原光束2°～5°的小角度范圍內(nèi)發(fā)生的散射現(xiàn)象。X射線穿過(guò)樣品時(shí)，在不均一材料電子密度起伏的作用下，會(huì)發(fā)生散射并形成特定的散射圖案，根據(jù)所得圖案可反推樣品微觀結(jié)構(gòu)。在進(jìn)行mRNA-LNP表征時(shí)，SAXS常與Cryo-EM結(jié)合使用，正如圖3所示，結(jié)合SAXS檢測(cè)所得曲線與Cryo-EM拍攝所得圖像，即可幫助研究者推斷/驗(yàn)證諸多信息，如LNP的多層狀結(jié)構(gòu)，各種脂質(zhì)的排布，純化前后脂質(zhì)排布的變化及不同脂質(zhì)濃度、不同NP比對(duì)脂質(zhì)排布的影響。
圖3.LNP的SAXS表征
多激光圓柱照明共聚焦光譜（CICS）
此方法旨在從單粒子水平上定量解析LNP的有效載荷，通過(guò)對(duì)LNP不同組分熒光標(biāo)簽的一致性分析和單mRNA熒光的定量解析（圖4），區(qū)分未封裝的mRNA、空載的LNPs和負(fù)載mRNA的LNPs。以DLin-MC3基準(zhǔn)配方來(lái)講，不同條件下，LNP自組裝的空載率為40%~80%，非空載的LNP大多含有2~3個(gè)mRNA分子。CICS為揭示LNP動(dòng)力學(xué)控制提供了觀測(cè)條件，也為mRNA-LNP構(gòu)效關(guān)系的研究給予了新的幫助。
圖4. LNP的CICS表征
單粒子分析器（SPP）
SPP采用市售共聚焦顯微鏡，基于溶液中數(shù)千個(gè)擴(kuò)散粒子的熒光波動(dòng)進(jìn)行分析（圖5a）。簡(jiǎn)而言之，熒光標(biāo)記的粒子在衍射受限的觀察體中擴(kuò)散，其發(fā)射的熒光在多通道中被連續(xù)檢測(cè)，使用自定義的免費(fèi)Python腳本可識(shí)別多通道的熒光強(qiáng)度波動(dòng)（圖5b），基于多通道中每個(gè)單峰的強(qiáng)度，可以構(gòu)建信號(hào)密度圖（圖5c）和每個(gè)通道的直方圖（圖5d）。
在包封分析中，SPP通過(guò)測(cè)量mRNA和脂質(zhì)染料的共現(xiàn)信號(hào)（圖5f），可以對(duì)單個(gè)LNP中mRNA的含量進(jìn)行定量分析，以得到完整LNP的占比（圖5g），以及單個(gè)LNP的mRNA包封量（圖5h）。
在包封分析中，SPP通過(guò)測(cè)量mRNA和脂質(zhì)染料的共現(xiàn)信號(hào)（圖5f），可以對(duì)單個(gè)LNP中mRNA的含量進(jìn)行定量分析，以得到完整LNP的占比（圖5g），以及單個(gè)LNP的mRNA包封量（圖5h）。
圖5.LNP的SPP表征
創(chuàng)建自組裝動(dòng)力學(xué)，完善表征手段是揭示mRNA-LNP構(gòu)效關(guān)系的必要方式，文中提到的表征方法，對(duì)mRNA-LNP的研究起到了很大的幫助作用，相信隨著科技的發(fā)展和相關(guān)理論的完善，此領(lǐng)域的研究將會(huì)取得更大的進(jìn)展。
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