利用NIR-II激發(fā)和發(fā)射的明亮金納米團(tuán)簇實(shí)現(xiàn)腎功能障礙熒光成像

本文要點(diǎn)：本研究首次合成了具有NIR-II激發(fā)和發(fā)射的腎清除金納米簇（Au NCs）。使用NIR-II光激發(fā)成像可提供深層組織穿透力、高分辨率和高信噪比。此外，開(kāi)發(fā)的Au NCs的量子產(chǎn)率高達(dá)1.4-2.0%，比以前的腎可清除NIR-II發(fā)射材料高出近10倍。這些顯著的優(yōu)點(diǎn)使Au NCs能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率熒光成像，以及監(jiān)測(cè)由腎缺血再灌注和單側(cè)輸尿管梗阻引起的腎功能障礙。本文的研究結(jié)果為NIR-II熒光成像提供了新的候選材料，并為腎臟疾病的高分辨率和精確成像提供了強(qiáng)大的工具。
 

 

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腎功能障礙在最初階段的癥狀非常隱蔽，但后期可能導(dǎo)致腎功能不全、腎衰竭，甚至死亡。據(jù)估計(jì)，全球每年有300萬(wàn)人患末期腎臟疾病，死亡數(shù)超過(guò)百萬(wàn)。因此，早期實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腎功能不全對(duì)開(kāi)展保護(hù)性干預(yù)和預(yù)防腎臟疾病的發(fā)展具有重要價(jià)值。

通過(guò)第二近紅外（NIR-II）熒光成像可以實(shí)現(xiàn)體內(nèi)腎功能障礙的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，對(duì)腎臟疾病的診斷和維護(hù)患者健康具有重要意義。然而，目前開(kāi)發(fā)的腎臟可清除NIR-II熒光材料的光穩(wěn)定性差、量子產(chǎn)率低、激發(fā)波長(zhǎng)短（均位于NIR-I區(qū)域），導(dǎo)致相鄰生物組織中的背景信號(hào)高，腎臟成像的分辨率和信噪比低，限制了其在腎臟疾病研究中的應(yīng)用。開(kāi)發(fā)具有優(yōu)異光物理性質(zhì)的新型腎清除NIR-II發(fā)光材料十分具有挑戰(zhàn)性，但在該領(lǐng)域有巨大價(jià)值。

本研究首次合成了具有NIR-II激發(fā)和發(fā)射雙重功能的腎透明金納米團(tuán)簇（gold nanoclusters, Au-NCs），具有深層組織穿透、高信號(hào)背景比和高量子產(chǎn)率等特點(diǎn)。這些優(yōu)點(diǎn)使Au-NCs能夠?qū)崿F(xiàn)高分辨率熒光成像，以及監(jiān)測(cè)腎缺血再灌注（Renal Ischemia Reperfusion, RIR）和單側(cè)輸尿管梗阻（Unilateral Uretera Obstruction, UUO）引起的腎功能障礙（方案1）。本研究為NIR-II熒光成像提供了新的候選材料，并為腎臟疾病的高分辨率和精確成像提供了有力的工具。

方案1. 雙配體穩(wěn)定的Au NCs的示意圖和NIR-II窗口中腎臟功能障礙的熒光成像監(jiān)測(cè)。
 

在本研究中，通過(guò)兩步反應(yīng)在水相中合成了一系列雙配體穩(wěn)定的Au NCs。Au-配體復(fù)合物是通過(guò)將HAuCl4與MHA和另一種配體（包括Cystm、ME、DTT）混合，并在堿性條件下用NaBH4還原而形成的。透射電子顯微鏡（TEM）圖像顯示，雙配體穩(wěn)定的Au NCs是具有良好單分散性的超小球形顆粒（圖1a-d）。雙配體Au NCs與單配體MHA-Au NCs的吸收和發(fā)射光譜存在明顯差異，雙配體Au NCs在1000nm附近顯示出明顯的吸收峰（圖1e）；其N(xiāo)IR-II發(fā)光相較于單配體MHA-Au NCs增強(qiáng)了近16倍（圖1f-g）。使用NIR-II熒光染料IR-26作為參考，計(jì)算得MHA/Cystm-Au NCs、MHA/ME-Au NCs和MHA/DTT-Au NCs的QY分別為1.4%、2.0%和1.7%，明顯高于先前開(kāi)發(fā)的腎可清除NIR-II熒光材料的值，說(shuō)明Au-NCs作為腎透明熒光材料在生物成像應(yīng)用中具有潛力。
 

圖1. NIR-II熒光圖像、TEM圖像和所制備的MHA-Au NCs（a）、MHA/Cystm-Au NCs（b）、MHA/ME-Au NCs（c）和MHA/DTT-Au NCs（d）的尺寸分布。（e）Au NCs的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜。（f）Au NCs的熒光發(fā)射光譜。（g）Au NCs的發(fā)光強(qiáng)度的比較。
 

作者以MHA/Cystm-Au NCs為模型，在水中使用1% Intralipid模擬生物軟組織進(jìn)行成像，進(jìn)一步評(píng)估了它們的NIR-II熒光成像的穿透深度、分辨率和SBR。發(fā)現(xiàn)穿透深度隨著激發(fā)波長(zhǎng)增加而增加（圖2a），1064nm激發(fā)下檢測(cè)到的熒光信號(hào)高于980和808 nm激發(fā)下的熒光信號(hào)，且熒光強(qiáng)度因材料厚度增加而降低的程度明顯更小（圖2b-c）。隨著激光和濾光片波長(zhǎng)的增加，SBR不斷增加，毛細(xì)管半峰全寬逐漸減�。▓D2d，e）。這些結(jié)果表明，采用長(zhǎng)波長(zhǎng)激發(fā)可以提高NIR-II成像的穿透深度、分辨率和SBR，也進(jìn)一步證明了雙配體穩(wěn)定的Au NCs用于生物成像的潛力。

圖2. （a）在不同激發(fā)（808、980和1064nm）下，用浸入1% Intralipid中的MHA/Cystm-Au NCs溶液填充的毛細(xì)管的熒光圖像。（b）來(lái)自（a）的沿著黃色箭頭的橫截面熒光強(qiáng)度分布。（c）MHA/Cystm-Au NCs在不同厚度（3、5和7mm）的Intralipid和不同激發(fā)激光下的熒光信號(hào)強(qiáng)度。（d）用不同的激發(fā)激光器和過(guò)濾器（2mm 1% Intralipid下）對(duì)填充有MHA/Cystm-Au NCs溶液的毛細(xì)管進(jìn)行NIR-II熒光成像。（e）截面熒光強(qiáng)度分布圖（黑色）和沿（d）中黃線的高斯擬合線（紅色）。

接著作者進(jìn)行了體內(nèi)熒光成像研究，通過(guò)小鼠尾靜脈注射ICG、MHA-Au NCs和雙配體Au NCs，在1064nm的激發(fā)下于NIR-II窗口中成像，探究所合成的Au NCs在腎臟中的成像性能。如圖3a所示，注射MHA/Cystm-Au NCs后5分鐘，腎臟即被清晰區(qū)分，并且沒(méi)有觀察到來(lái)自鄰近組織的明顯干擾信號(hào)。隨著MHA/Cystm-Au NCs從腎臟中清除，腎臟區(qū)域的熒光強(qiáng)度逐漸降低，接著Au NCs通過(guò)輸尿管進(jìn)入膀胱，在10分鐘時(shí)可觀察到膀胱區(qū)域的熒光信號(hào)，并在注射后3小時(shí)達(dá)到最大值。隨后，Au NCs隨尿液排出體外。值得注意的是，MHA/Cystm-Au NCs的腎臟成像分辨率遠(yuǎn)高于先前文獻(xiàn)中報(bào)道的分辨率，腎臟區(qū)域的SBR高達(dá)4.53（圖3b-c）。與MHA/Cystm Au NC相比，ICG和其他Au NCs對(duì)腎臟的成像能力相對(duì)較弱，SBR值相對(duì)較低。這證明了MHA/Cystm-Au NCs具有良好的腎臟成像能力。

圖3.（a）靜脈注射MHA/Cysm-Au NCs后24小時(shí)內(nèi)KM小鼠的NIR-II熒光成像。（b）分別在靜脈注射MHA/Cysm-Au NCs、MHA/ME-Au NC、MHA/DTT-Au NCs、ICG和MHA-Au NCs后5分鐘KM小鼠的NIR-II熒光成像。（c）來(lái)自（b）的沿著黃線的橫截面熒光強(qiáng)度分布（黑色）和高斯擬合線（紅色）。

在上述研究的基礎(chǔ)上，作者使用MHA/Cystm-Au NCs分別對(duì)RIR和UUO誘導(dǎo)的腎功能障礙進(jìn)行成像，以評(píng)估其實(shí)際應(yīng)用能力。

RIR是腎臟疾病手術(shù)中的一種常見(jiàn)現(xiàn)象，容易導(dǎo)致急性腎損傷，并有發(fā)展為終末期腎臟疾病、帶來(lái)高死亡率的風(fēng)險(xiǎn)。作者通過(guò)手術(shù)夾閉小鼠腎動(dòng)脈和靜脈建立RIR小鼠模型。將兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組小鼠的左腎分別夾緊30和60分鐘；假手術(shù)組在沒(méi)有夾腎的情況下進(jìn)行了相同的手術(shù)，然后在術(shù)后15分鐘靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs，在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)小鼠進(jìn)行成像（圖4a）。成像結(jié)果如圖4b所示。在假手術(shù)組小鼠中，左腎和右腎的熒光強(qiáng)度相當(dāng)，并具有相同的衰減趨勢(shì)（圖4c-d）；對(duì)于缺血30分鐘的小鼠，左腎的熒光強(qiáng)度在5分鐘內(nèi)增加到峰值，然后降低，下降的速度比假手術(shù)組慢，左腎和右腎的熒光強(qiáng)度比逐漸增加到1.3，這是由于缺血引起的左腎損傷，導(dǎo)致腎臟清除緩慢；對(duì)于缺血60分鐘的小鼠，左腎的熒光強(qiáng)度在注射后10分鐘達(dá)到最大值，隨后降低，與缺血30分鐘相比，熒光強(qiáng)度下降的速度更慢，左腎與右腎的熒光強(qiáng)度比逐漸增加到2.2，表明缺血腎的清除率進(jìn)一步減慢。這些結(jié)果表明，腎缺血時(shí)間越長(zhǎng)，腎臟在注射Au NCs后達(dá)到最大熒光的時(shí)間越長(zhǎng)以及左腎和右腎的熒光之間的差異越大。隨著成像時(shí)間的增加，缺血性腎臟的SBR逐漸高于非缺血性腎臟（圖4e）。

圖4. （a）RIR小鼠模型的構(gòu)建和RIR小鼠NIR-II熒光成像的時(shí)間線的示意圖。（b）靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后RIR小鼠在不同時(shí)間點(diǎn)的NIR-II熒光成像。（c） 注射MHA/Cystm-Au NCs后缺血腎臟熒光強(qiáng)度的變化（*p＜0.05，**p＜0.01）。（d）RIR小鼠左腎和右腎的熒光強(qiáng)度比。（e）SBR用于靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后不同時(shí)間點(diǎn)RIR小鼠缺血性腎臟的熒光成像。
 

UUO法常用于腎間質(zhì)纖維化模型的制備。梗阻后，尿液潴留壓迫腎小管，導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞進(jìn)行性壞死，間質(zhì)急慢性炎細(xì)胞浸潤(rùn)，壞死的腎小管組織逐漸被纖維瘢痕取代，最終形成進(jìn)行性腎間質(zhì)纖維化。作者通過(guò)外科縫線完全結(jié)扎小鼠左輸尿管建立UUO模型。結(jié)扎一段時(shí)間后，將MHA/Cystm-Au NCs靜脈注射到小鼠中，并在注射后的不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行NIR-II熒光成像（圖5a）。如圖5b所示，在注射后5分鐘檢測(cè)到腎臟中的NIR-II發(fā)光信號(hào)，并隨著時(shí)間的推移逐漸減弱。在接受輸尿管結(jié)扎0分鐘和30分鐘的小鼠中，左腎和右腎的信號(hào)之間沒(méi)有觀察到明顯的差異；在接受輸尿管結(jié)扎24小時(shí)的小鼠中，左腎的熒光顯著低于右腎（圖5c），且左腎的SBR低于右腎的SBR（圖5d）。表明輸尿管結(jié)扎24小時(shí)會(huì)導(dǎo)致腎濾過(guò)異常，結(jié)扎30分鐘則無(wú)顯著影響。

此外，作者還對(duì)兩組模型分別進(jìn)行了H&E染色分析驗(yàn)證腎損傷情況。結(jié)果顯示，使用UUO模型的實(shí)驗(yàn)中，與假手術(shù)組的腎臟相比，UUO 24小時(shí)后，腎臟腎小管輕度擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞少量壞死脫落，證實(shí)了UUO 24 小時(shí)誘導(dǎo)的輕微腎損傷。而在使用RIR誘導(dǎo)的腎損傷模型的實(shí)驗(yàn)中，與未缺血的小鼠相比，缺血60min的小鼠的腎臟結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了一些明顯的損傷，表明60min的夾閉導(dǎo)致了嚴(yán)重的腎損傷。該結(jié)果與熒光成像結(jié)果一致，因?yàn)槿毖?0分鐘的小鼠觀察到最高熒光信號(hào)的時(shí)間晚于UUO 24小時(shí)的小鼠（圖4b, 5b）。這說(shuō)明所制備的Au-NCs能夠區(qū)分不同的腎損傷情況，驗(yàn)證了Au-NCs對(duì)腎功能障礙成像的能力。
 

圖5. （a）UUO小鼠模型的建立和NIR-II熒光成像的示意圖。（b）輸尿管結(jié)扎0分鐘、30分鐘和24小時(shí)的UUO小鼠靜脈注射MHA/Cystm-Au NCs后的NIR-II熒光成像。（c）沿圖中黃線的橫截面熒光強(qiáng)度圖。（d）注射MHA/Cystm-Au NCs后5分鐘，不同結(jié)扎時(shí)間的UUO小鼠腎臟熒光成像的SBR。
 

總之，本研究成功合成了一系列具有NIR-II激發(fā)和發(fā)射的雙配體穩(wěn)定的Au NCs，可用于體內(nèi)RIR和UUO誘導(dǎo)的腎功能障礙的高分辨率熒光成像。與以往的腎功能NIR-II成像相比，在NIR-II激發(fā)下的熒光成像可以更清晰地顯示腎臟，實(shí)現(xiàn)對(duì)腎功能障礙的更準(zhǔn)確診斷，為腎功能障礙的高分辨率精確成像提供了有力的工具。

參考文獻(xiàn)
Yi, S.; Hu, Q.; Chi, Y.; Qu, H.; Xiao, Y., Bright and Renal-Clearable Au Nanoclusters with NIR-II Excitation and Emission for High-Resolution Fluorescence Imaging of Kidney Dysfunction. ACS Materials Letters 2023, 5 (8), 2164-2173.
 

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