納米抗體淘選體系選擇介紹

噬菌體展示技術(shù)由喬治-史密斯（George P. Smith）于 1985 年最早描述，他報道了在絲狀噬菌體（感染細(xì)菌的細(xì)長病毒）上展示肽的方法，即從一系列肽序列中將病毒的外殼蛋白與一種肽融合。1988 年，斯蒂芬-帕姆雷（Stephen Parmley）和喬治-史密斯描述了用于親和力篩選的生物淘篩（biopanning），并證明逐輪篩選可以富集出十億分之一或更少出現(xiàn)的克隆。1990年，吉米-司各特（Jamie Scott）和喬治-史密斯描述了在絲狀噬菌體上展示的大型隨機肽庫的創(chuàng)建過程。格雷格-溫特（Greg Winter）和約翰-麥卡弗蒂（John McCafferty）所在的分子生物學(xué)實驗室、理查德-勒納（Richard Lerner）和卡洛斯-巴巴斯（Carlos Barbas）所在的斯克里普斯研究所以及弗蘭克-布賴特林（Frank Breitling）和斯特凡-杜貝爾（Stefan Dübel）所在的德國癌癥研究中心的研究小組進一步開發(fā)和改進了噬菌體展示技術(shù)，用于展示治療蛋白質(zhì)工程中的抗體等蛋白質(zhì)。史密斯和溫特因開發(fā)噬菌體展示技術(shù)的貢獻而獲得了 2018 年諾貝爾化學(xué)獎的一半份額。1985 年，喬治-皮克澤尼克（George Pieczenik）要求優(yōu)先權(quán)的一項專利也描述了肽庫的生成過程。

噬菌體抗體庫技術(shù)是目前應(yīng)用廣泛的基因工程抗體制備技術(shù)，在人源抗體的克隆、抗體性能的修飾、抗體基因的研究等方面具有重要的理論和實用價值�？贵w庫展示技術(shù)的篩選能力為其應(yīng)用發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。而能否從抗體庫中獲得預(yù)期的抗體受到很多因素的制約，包括抗體庫的存儲容量、多樣性、存儲條件、擴增和篩選流程等，篩選策略需要根據(jù)抗原的性質(zhì)來確定。其他篩選策略的選擇依據(jù)如下文所述：

抗原性質(zhì)明確時，使用固相篩選法和液相篩選法。

固相篩選法通過將抗原包被在酶標(biāo)板或其他固相介質(zhì)上來富集表達高親和性抗體的噬菌體。該法有兩種篩選方式：ELISA微孔板篩選和免疫試管篩選。當(dāng)抗體庫容量較大，預(yù)期目標(biāo)抗體的拷貝數(shù)較多，親和力較強且抗原來源豐富時，固相抗原篩選法最常用。固相篩選法的缺點有：消耗大量抗原、部分抗原與固相介質(zhì)結(jié)合后會破壞表位、不易定量、對抗體親和力的選擇效果不佳。因此，在抗原有限等以上這些情況下可以選擇液相篩選法。

液相篩選法是在與親和素偶聯(lián)的磁珠或瓊脂糖上包被生物素化的抗原進行抗體篩選。液相篩選法的篩選效率高，增加了噬菌體顆粒與抗原接觸的機率，能有效地將數(shù)量少或親和力低的抗體從文庫中分離出來。通過多次篩選，可以得到表達高親和力抗體的噬菌體。

抗原無法純化或性質(zhì)未知時，就需要開發(fā)新的篩選方法來建立噬菌體展示抗體庫。目前比較成熟的有細(xì)胞篩選方法、組織篩選或體內(nèi)篩選方法、選擇感染篩選方法、蛋白質(zhì)芯片篩選方法等。

細(xì)胞篩選方法可以保持抗原和抗體的天然構(gòu)象，多用于腫瘤細(xì)胞抗體篩選，還適用于細(xì)胞表面受體及抗原鑒定。而由于細(xì)胞膜成分復(fù)雜，會增加非特異性結(jié)合，因此需要去除非特異性結(jié)合的背景。最常用的去除背景的方法是用不表達特異性抗原的細(xì)胞（空白細(xì)胞）預(yù)吸附抗體庫，去除非目標(biāo)抗體（負(fù)選擇），然后用吸附的噬菌體結(jié)合目標(biāo)抗體。靶細(xì)胞獲得靶細(xì)胞結(jié)合抗體（正選擇），經(jīng)過幾輪“負(fù)選擇-正選擇-擴增”，針對靶分子的抗體噬菌體被富集。但多次篩選容易丟失特異性結(jié)合的抗體噬菌體，喪失多樣性。因此該方法的應(yīng)用并不廣泛，在此方法基礎(chǔ)上開發(fā)了扣除篩選、競爭篩選、內(nèi)化篩選等方法。

組織篩選或體內(nèi)篩選方法多用于臨床研究。組織篩選方法是利用新鮮的組織切片進行抗體篩選，但由于組織本身抗原數(shù)量有限，限制了噬菌體抗體的回收效率。體內(nèi)篩選方法是將待篩選抗體庫通過靜脈注射進小鼠體內(nèi)，然后取出組織或靶器官，回收噬菌體，經(jīng)過3-4輪的富集可得到特異性抗體。與體外篩選相比，此類組織和細(xì)胞處于天然的三維微環(huán)境中，篩選結(jié)果更加真實。但體內(nèi)篩選效率低、篩選難度大、對文庫要求較高——通常要求文庫的多樣性達到10⁸-10⁹。同時，應(yīng)盡量減少空噬菌體的含量。

選擇感染篩選法是將PⅢ蛋白的氨基端結(jié)構(gòu)域（NT）用特定的多肽或蛋白替代，然后這些多肽或蛋白與帶有NT端的配基特異性結(jié)合時，才會有感染能力，因此在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)繁殖富集，得到特異性抗體。

蛋白芯片篩選法利用高通量蛋白功能分析技術(shù)，將有大量不同種類的蛋白質(zhì)點樣在載體上，可同時檢測這些抗原抗體的反應(yīng)，通過掃描儀讀取熒光強度，可以利用計算機對待測樣品進行分析計算。蛋白質(zhì)芯片不僅具有高通量的特點，還可以高靈敏性和低假陽性的篩選抗體。