NEPA21助力：anti-EpCAM CAR-T 細(xì)胞有效地抑制腹膜腫瘤的病情發(fā)展

腹膜轉(zhuǎn)移癌（PC）是癌細(xì)胞經(jīng)血路腹膜轉(zhuǎn)移或腹膜直接種植生長所致。多繼發(fā)于腹腔內(nèi)肝、胃、結(jié)腸、胰腺和卵巢、子宮的癌腫和腹膜后的惡性腫瘤，也可繼發(fā)于肺、腦、骨骼、鼻咽部的腫瘤以及皮膚黑色素瘤等。患者病情發(fā)展快、預(yù)后性差。近年來發(fā)展的利用基因改造技術(shù)表達(dá)腫瘤特異性嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）的T細(xì)胞顯示出的靶向性、殺傷活性和持久性，或許將為腹膜轉(zhuǎn)移癌的治療注入了新方案。
 

CAR-T治療中的細(xì)胞基因改造環(huán)節(jié)，主要有依靠病毒的轉(zhuǎn)導(dǎo)和非病毒載體的轉(zhuǎn)染兩種技術(shù)路線。值得關(guān)注的是，由于病毒載體生產(chǎn)的工藝復(fù)雜性和低效率，以及由于病毒載體具有潛在的致病性，所以要求更嚴(yán)格的質(zhì)量控制和安全性檢測，這些因素都導(dǎo)致病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)的環(huán)節(jié)的成本較高，在CAR-T生產(chǎn)的總成本中占重要比重。提高病毒載體的生產(chǎn)效率和規(guī)模會有助于解決這一成本瓶頸，而現(xiàn)今也有用戶在嘗試另一種解決方案——即，采用非病毒載體的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)。研究者認(rèn)為，非病毒的轉(zhuǎn)染技術(shù)可以大大簡化了病毒載體相關(guān)的供應(yīng)鏈限制和成本負(fù)擔(dān)，相關(guān)的技術(shù)有轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座子酶系統(tǒng)（Transposon/transposase system）、基因編輯技術(shù)如 ZFN, TALENs, and CRISPR/Cas9 等。使用電轉(zhuǎn)染（electroporation）系統(tǒng)可以有助于提高此類非病毒載體的轉(zhuǎn)染效率，從而降低基因改造環(huán)節(jié)的復(fù)雜性和成本，是非常值得嘗試的事情。

2017年1月10日在OncoTarget發(fā)表一篇文章，“Intraperitoneal immunotherapy with T cells stably and transiently expressing anti-EpCAM CAR in xenograft models of peritoneal carcinomatosis”，描述了一種治療終末期PC的嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞療法，為腫瘤的臨床實驗提供新視角。

研究者利用4D5MOC-B單鏈可變片段構(gòu)建了EpCAM特異性的第三代CAR。文章中，作者嘗試了基于mRNA電穿孔的技術(shù)，獲得 抗EpCAM CAR-T細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，“將mRNA導(dǎo)入具有抗EpCAM CAR瞬時表達(dá)的T細(xì)胞中可延遲荷瘤小鼠的疾病進(jìn)展。通過腹膜移植于小鼠（16天前接種的腫瘤細(xì)胞）中也觀察到了良好的治療效果。這一發(fā)現(xiàn)提示了通過定期重復(fù)注射轉(zhuǎn)染了EpCAM靶向CAR的mRNA的T細(xì)胞來減少癌癥患者疾病是一種有趣的治療方法，該方法很有吸引力。” 作者認(rèn)為，這項療法可能被用于治療晚期PC，但目前實驗只是在小鼠身上取得了初步成功，該項技術(shù)是否安全、有效，值得臨床前和臨床進(jìn)一步評價。

本實驗中研究者們使用了NEPA21 電轉(zhuǎn)系統(tǒng)：

文中表明，“經(jīng)GFP mRNA優(yōu)化后，用mRNA電穿孔的人T細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率為97%（圖A）。用MgFP RNA載體對T細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，轉(zhuǎn)染效率為79%（圖A）。然后用流式細(xì)胞儀分析，用Fc特異性抗體檢測編碼抗EpCAM CAR的mRNA在人T細(xì)胞中的表達(dá)，表達(dá)量高達(dá)68.5%（圖 B）。

(A) The electroporation efficiency in T cells. The cells were transfected with normal GFP mRNA for cytoplasm expression and mGFPmRNA CFP expression was examined by flow cytometry.

(B) Flow cytometric analysis to examine anti- EpCAM CAR expression on T cells after electroporation. The cells were collected 24 hours after electroporation for analysis.

NEPA21讓轉(zhuǎn)染更簡單、更Free

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可實現(xiàn)懸浮細(xì)胞、貼壁細(xì)胞、受精卵、活體動物及離體組織器官的高效轉(zhuǎn)染，包括鼠、兔、魚、爪蟾\蝌蚪、蜜蜂、蟋蟀、蠶、水蚤、渦蟲等各種活體及受精卵胚胎的轉(zhuǎn)染，還可以用于植物種子、微藻等的電轉(zhuǎn)化。配合獨有的電壓衰減（Voltage Decay）設(shè)計，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時，提高細(xì)胞存活率。
 

摘錄文獻(xiàn)

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