光片顯微鏡技術(shù)原理及應(yīng)用

自17世紀(jì)荷蘭科學(xué)家列文虎克研制出光學(xué)顯微鏡以來，人類對于微觀世界的探索如火如荼。光學(xué)顯微鏡由于其對樣品損傷低、成像機制多等優(yōu)點，已經(jīng)成為了微觀醫(yī)學(xué)研究上不可或缺的工具。隨著生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究不斷拓展，對于光學(xué)顯微鏡的成像速度、空間分辨率、成像質(zhì)量等方面也提出了更高的要求。

目前新型顯微鏡主要有雙光子、共聚焦、光片等顯微鏡。而光片顯微鏡在近幾年飛速發(fā)展，以大視野、成像速度快、低光毒性、低光漂白等優(yōu)勢而被廣泛關(guān)注。

光片顯微鏡原理
    光片熒光顯微鏡，是一種新型的三維顯微成像技術(shù)，采用正交光路設(shè)計，用一層薄光片從側(cè)面激發(fā)樣品，并且在垂直于光片的方向上利用顯微物鏡和數(shù)字相機拍攝樣品的二維熒光圖像，通過軸向掃描光片或移動樣品逐面成像，獲取不同深度處的層析圖像最終實現(xiàn)樣品的三維重構(gòu)。 光片顯微鏡的優(yōu)勢
1. 大視野、成像速度快
光片顯微鏡采用的是高QE的CCD或者sCMOS相機，可以做到面成像，大大提高了成像的速度和圖像的信噪比。工作時，光片一次曝光穿過樣品，得到的光學(xué)切片可以得到在此平面上樣品的全部信息，大大減少了成像需要的時間。
2. 低光毒性、低光漂白
光毒性是指在較長時間的強光照射下，生物樣本細胞內(nèi)的熒光分子會產(chǎn)生分解現(xiàn)象。光漂白是指熒光成像的質(zhì)量很大程度上依賴于熒光信號強度，提高激發(fā)光強度固然可以提高信號強度，但當(dāng)激發(fā)光的強度超過一定限度時，光吸收就趨于飽和，并不可逆地破壞激發(fā)態(tài)分子。
光片顯微鏡與傳統(tǒng)的熒光照明技術(shù)相比，光照是從樣品的側(cè)面發(fā)出，只會照亮平面上的樣品組織，這樣光毒性可以被降低很多倍，可以在更接近生理狀態(tài)的條件下，對活體生物樣品進行長時間的三維成像。
3. 對比度高
提高了圖像和背景的反差和軸向分辨率，光片照明技術(shù)使焦平面上下的樣品不會被激發(fā)。
  樣品組織透明化
由于細胞中的色素及其它成分對光的散射和吸收，使光難以達到生物組織的深處。組織透明化技術(shù)（Tissue Clearing）是破解這一難題最重要的技術(shù)手段之一。生物組織是由不同光學(xué)特性的非均質(zhì)成分組成，這會使入射光進入之后發(fā)生散射，限制光學(xué)成像的深度。對此，目前科研人員開發(fā)了三種組織透明化的方法。
①油性生物組織透明化方法
油性組織透明化主要是利用帶有高折射率介質(zhì)的光學(xué)透明劑取代組織中原本的水分和脂質(zhì)來平衡折射率，這種方法透明化效果較好，但是熒光蛋白容易被破壞，信號不易保存。
②水凝膠透明化方法
水凝膠方法主要是將樣品包埋在水凝膠中，使樣品中的蛋白質(zhì)和核酸分子與水凝膠形成共價連接，從而起到保護和固定作用。
③水性生物組織透明化方法
由于組織中的熒光蛋白分子帶有親水基團，所以與油性透明化方法相比，水性更利于熒光信號保存，但是也存在透明時間較長、透明度差等缺點。目前分為單純浸泡透明與高水化脫脂透明兩種方法。單純浸泡是利用滲透壓的原理，將組織樣品泡在高折射率溶液中，使得組織內(nèi)外被溶液被替換，從而平衡折射率。高水化法是利用氨基醇類與去垢劑類物質(zhì)將樣品組織的脂質(zhì)去除，然后利用水化作用降低樣品折射率實現(xiàn)組織透明化。
光片顯微鏡應(yīng)用范圍
借助于光片顯微鏡，腦科學(xué)可應(yīng)用于全腦神經(jīng)、血管等結(jié)構(gòu)三維高精度成像，用于神經(jīng)退行性疾病、腦栓塞等研究；神經(jīng)科學(xué)可以研究神經(jīng)元神經(jīng)傳導(dǎo)途徑及修復(fù)再生能力；呼吸科學(xué)可以用于呼吸系統(tǒng)致病及肺損傷機制、免疫應(yīng)答及藥物篩選研究；腫瘤學(xué)可以用于腫瘤微環(huán)境，轉(zhuǎn)移，侵襲及藥物篩選；免疫學(xué)科也可以更完整的研究淋巴系統(tǒng)的發(fā)育過程；骨科學(xué)可以用于骨骼修復(fù)與骨再生相關(guān)研究；發(fā)育科學(xué)可以用于研究模型動物各個階段的組織與器官的發(fā)育和功能。