抗體文庫細胞篩選方案介紹

與固相篩選相比，使用完整細胞作為篩選底物的最大優(yōu)勢在于細胞膜表面的受體保持天然構(gòu)象，受體蛋白無需純化，更有利于篩選功能性抗體。噬菌體抗體庫不僅可以通過與細胞結(jié)合進行篩選，還可以通過內(nèi)化進行篩選。由于配體-受體結(jié)合后，配體-受體復合物可通過細胞內(nèi)化作用被吞入細胞，因此這種方法可用于篩選可通過細胞內(nèi)化作用被內(nèi)化的噬菌體抗體�？贵w-抗原結(jié)合可以模擬這一過程，因此這種方法可用于篩選可被細胞內(nèi)化的抗體。

 

一．細胞篩選原理

 

細胞表面分布著大量的信號分子，它們反映了細胞的特性以及所處的功能狀態(tài)。雖然可以將分子直接作為篩選標靶，但對于純化困難或表達量少的受體等分子，它們需要完整的細胞膜，或者與細胞膜上的其他亞單位形成復合物才能發(fā)揮作用。

 

二．全細胞篩選的優(yōu)缺點

  

 

優(yōu)點	缺點
1、不需要對受體分子進行純化，也不需要分析受體結(jié)構(gòu)，且受體處于天然構(gòu)想狀態(tài)，能保證其真實的結(jié)合活性； 2、不需要預(yù)先確定具體的目的受體，可以尋找細胞表面未知受體及其配體分子； 3、還能夠篩選到內(nèi)在化的受體，用于某些疾病靶向藥物的開發(fā)； 4、可與細胞功能實驗相結(jié)合，直接篩選到對某種細胞膜分子的功能及細胞表型有影響的活性肽。	1、細胞膜表面具有大量的生物活性大分子，其多樣性和結(jié)構(gòu)的復雜多變性使非特異性結(jié)合占有很高的比例； 2、反復數(shù)輪的“吸附-洗脫-擴增”會使細胞與特異性結(jié)合配體的損失嚴重； 3、有些蛋白在細胞中的表達量很少，當表達量低于文庫中任何一個多肽的親和力常數(shù)時，就很難得到預(yù)期的效果； 4、細胞膜上的其他蛋白或糖基造成的空間結(jié)構(gòu)可影響對目的多肽的結(jié)合。

 

三．全細胞篩選策略

   

 

	篩選已知細胞表面受體	篩選未知細胞表面受體
基本思路	在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)抗體庫中不含目標受體的空白細胞，去除非目標抗體（即陰性篩選），然后用未吸附的噬菌體與目標細胞結(jié)合，獲得與目標細胞結(jié)合的抗體（即陽性篩選），經(jīng)過幾輪“陰性篩選-陽性篩選-擴增”，就能富集出特異性抗體。	篩選細胞表面的未知受體往往會得到針對細胞表面大量分子受體的抗體，因此必須避免抗體與正常組織之間的交叉反應(yīng)。有必要選擇合適的陰性細胞來篩查背景，提高信噪比。
缺點	在陰性選擇過程中，非特異性噬菌體不能被有效屏蔽，在陽性篩選過程中，一些拷貝數(shù)小的陽性克隆容易丟失，富集的抗體克隆大多是非特異性的，在數(shù)量和多樣性上都遠不如純抗原。	在受體抗原性質(zhì)不確定、功能受體表達稀缺的復雜抗原環(huán)境中，篩選往往會受到受體偏差和多樣性的干擾，使篩選效率低下，產(chǎn)生較高的篩選背景。此外，該技術(shù)操作難度大，回收的噬菌體少，抗體親和力低，開發(fā)價值不大。

 

四．細胞篩選的實驗流程

 

(1) 細胞處理：篩選用細胞中加入EDTA，4℃、1000rpm離心10min；

(2) 洗滌：處理好的細胞用無血清DMEM培養(yǎng)基4℃、2000rpm離心1min，洗滌1-2次；

(3) 孵育噬菌體：取提前制備的噬菌體溶液加入至篩選細胞中，加入DMEM培養(yǎng)基，4℃孵育2h；

(4) 洗滌：孵育好的細胞用無血清DMEM培養(yǎng)基4℃、3000rpm離心1min，洗滌8-10次，再用PBST洗滌3次；

(5) 洗脫：4℃、3000rpm離心5min離心，棄去上清，加入Tris-HCl(pH=3.0)，重懸細胞，4℃、4000r離心5min，迅速用Tris-HCl(pH=8.0)中和至約pH=7.0。

(6) 活化2738：取兩支離心管，倒入LB 液休培養(yǎng)基，加入四環(huán)不素，其中一支加入從2738平板上挑一個單個菌落，另一支做空白對照，37℃，250r的搖床內(nèi)培養(yǎng)4h。

(7) 洗脫產(chǎn)物稀釋：取3支無菌的1.5ml離心管，分別加入無菌的LB培養(yǎng)基，向第一管內(nèi)加入脫產(chǎn)物，混勻，從第一支內(nèi)取出加入第二支管內(nèi)，混勻，再從第二管取出加入第三管內(nèi)，混勻。

(8) 侵染：取3支無菌的離心管，分別加入活化好的2738菌液，及稀釋的洗脫產(chǎn)物（一個梯度一支管），在37°C放置1.5h。

(9) 倒板：向侵染的菌液加入3-4ml 己加過IPTG及x-gal的上層膠，混勻，倒在IPTG+X-gal的平板上（平板需先在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)熱至少1h），放在37°C培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)過夜。

 

五．當前比較成功的細胞篩選方法主要有：

 

(1) 差減篩選：應(yīng)用該方法從噬菌體抗體庫中篩選靶向黑色素瘤細胞的抗體。舉例具體操作：先用黑色素瘤細胞進行幾輪陽性篩查，然后用正常黑色素瘤進行陰性篩查，以扣除不與陽性細胞特異性結(jié)合的抗體。由于細胞表面抗原濃度低，加上演繹篩選的固有缺陷，這種篩選方法非常困難。

(2) 細胞內(nèi)化篩選：某些抗體與細胞表面抗原結(jié)合，抗原-抗體復合物可以被吞噬到細胞中，因此可以使用細胞內(nèi)化篩選方法來篩選此類抗體。有研究證明，這種篩選方法是可行的，而且比細胞表面篩選更容易獲得特異性噬菌體抗體。

 

六．全細胞篩選法的應(yīng)用

 

全細胞篩選法可應(yīng)用于尋找新的受體、配體及抗原表位分析，新型肽苗的開發(fā)，基因治療靶向載體的篩選，腫瘤靶向治療載體的篩選，酶受體激動劑和拮抗劑的開發(fā)，疾病的檢測及治療等多個方面。

 

我們在文庫構(gòu)建方面具有成熟穩(wěn)定的技術(shù)，噬菌體展示技術(shù)提供1級免疫文庫的建庫庫容為10⁸-10⁹，插入率均滿足>95%，篩選獲得的抗體親和力普遍處于nM-pM級別。具備多種篩選體系，包括直接篩選法、競爭法、負篩選法、細胞篩選法等，可提供VHH篩選、scFv序列篩選、Fab抗體篩選等，滿足不同客戶的不同需求。產(chǎn)品交付標準高：針對免疫庫，交付免疫前后血清，抗體展示文庫，篩選洗脫產(chǎn)物，CDR區(qū)域補充度的納米抗體序列，QC質(zhì)控標準（含RNA提取，cDNA制備等）。