慢病毒高通量表征平臺(tái)的應(yīng)用方案：粒徑、濃度檢測(cè)、膜染料測(cè)定純度等

在臨床應(yīng)用中，慢病毒作為細(xì)胞與基因治療的常用載體，相關(guān)制劑的純度和質(zhì)量均需符合GMP標(biāo)準(zhǔn)。而慢病毒生產(chǎn)過(guò)程中會(huì)引入非病毒成分的雜質(zhì)（如細(xì)胞碎片、蛋白聚集體）和病毒成分的雜質(zhì)（如空殼病毒、游離RNA等）。因此，對(duì)生產(chǎn)過(guò)程中以及慢病毒終產(chǎn)品進(jìn)行多維度的定量分析必不可少，亟需一種快速、高通量的慢病毒顆粒滴度、純度、空殼率等指標(biāo)的檢測(cè)方法。

NanoFCM基于自身的技術(shù)平臺(tái)開(kāi)發(fā)了一種高靈敏、快速、直接、無(wú)創(chuàng)的慢病毒表征解決方案，在前期研發(fā)、生產(chǎn)、純化、質(zhì)控、穩(wěn)定性評(píng)估等各個(gè)階段均具有極高的應(yīng)用價(jià)值。該方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、適用性廣，適用于不同種類(lèi)的病毒樣顆粒和病毒載體的分析。主要優(yōu)勢(shì)如下，

低損耗
僅需（10 mＬ）上樣量，且單次檢測(cè)樣品消耗量不足1 mＬ。

多參數(shù)
單次檢測(cè)可實(shí)現(xiàn)多種結(jié)構(gòu)組分鑒定，為慢病毒顆粒滴度、純度、空殼率等信息提供快速檢測(cè)方案。

高通量
檢測(cè)僅需2-3 min即可獲得高通量并具有統(tǒng)計(jì)代表性的數(shù)據(jù)結(jié)果，擁有完整的試劑解決方案，無(wú)需摸索實(shí)驗(yàn)流程。
 

圖.慢病毒高通量表征平臺(tái)

本期小編將基于慢病毒的表征平臺(tái)展開(kāi)方案介紹：

粒徑、濃度檢測(cè)
納米流式檢測(cè)儀以每分鐘高達(dá)上萬(wàn)個(gè)顆粒的檢測(cè)速率實(shí)現(xiàn)單個(gè)慢病毒的逐一檢測(cè)，獲得具有統(tǒng)計(jì)代表性的粒徑分布和濃度信息（如下圖1所示），也可快速獲得不同亞群的信息，對(duì)慢病毒樣品進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)琋anoFCM的檢測(cè)結(jié)果與稀釋度呈現(xiàn)很好的線(xiàn)性結(jié)果（R²>0.99）。這種多、快、省的檢測(cè)方法，可用于慢病毒生產(chǎn)過(guò)程中增殖狀態(tài)的實(shí)時(shí)監(jiān)控。
 

圖1. 慢病毒粒徑、濃度和稀釋線(xiàn)性測(cè)試

膜染料測(cè)定純度
我司研發(fā)的膜染料可對(duì)慢病毒生產(chǎn)過(guò)程中無(wú)膜結(jié)構(gòu)的顆粒進(jìn)行純度分析，經(jīng)脂膜染料標(biāo)記，結(jié)果顯示該慢病毒樣本純度為91.2%（如圖2所示），揭示慢病毒樣本中絕大部分為具有膜結(jié)構(gòu)的顆粒，且熒光強(qiáng)度與顆粒粒徑正相關(guān)。
 

圖2. 膜染料標(biāo)記的慢病毒純度（膜染料訂購(gòu)信息如下表所示）
 

核酸包裝效率分析
核酸染料可透過(guò)慢病毒莢膜及衣殼蛋白，與內(nèi)部核酸分子結(jié)合而發(fā)出熒光。如圖3所示，該慢病毒載體樣本中絕大部分的顆粒成功裝載了基因組（89.7%），但仍存在一部分未裝載核酸的慢病毒顆粒。
 

圖3. 核酸染料標(biāo)記的慢病毒純度（核酸染料訂購(gòu)信息如下表所示）
 

慢病毒膜內(nèi)蛋白p24測(cè)定
經(jīng)膜透化試劑處理和抗體標(biāo)記，NanoFCM可對(duì)慢病毒莢膜內(nèi)部的蛋白進(jìn)行定量分析，從而實(shí)現(xiàn)p24等慢病毒內(nèi)部蛋白的檢測(cè)。下圖4顯示的是該慢病毒樣本中，p24陽(yáng)性率僅為55.1%，結(jié)合上述莢膜和核酸染色的數(shù)據(jù)揭示并非所有的慢病毒顆粒均有p24蛋白的表達(dá)。
 

圖4. 病毒內(nèi)部蛋白p24檢測(cè)（p24檢測(cè)相關(guān)試劑訂購(gòu)信息如下表所示）

功能性慢病毒測(cè)定
慢病毒樣本中往往是多種組分共存，如完整慢病毒、部分組裝的慢病毒、游離核酸等。VSV-G陽(yáng)性的慢病毒可侵染細(xì)胞——“識(shí)別”，核酸陽(yáng)性慢病毒攜帶靶基因——“貨物”，故功能完整的慢病毒需要同時(shí)具有基因組和VSV-G。如下圖5所示，通過(guò)對(duì)慢病毒樣品進(jìn)行核酸和VSV-G蛋白熒光標(biāo)記，NanoFCM僅需要2-3 min就可以區(qū)分完整病毒、空殼、游離核酸等不同結(jié)構(gòu)。
 

圖5 功能性慢病毒顆粒檢測(cè)（病毒組分鑒定相關(guān)試劑如下表所示）

慢病毒滴度測(cè)定比較
慢病毒滴度測(cè)定常通過(guò)ELISA對(duì)p24進(jìn)行定量分析進(jìn)而計(jì)算出慢病毒物理滴度，或通過(guò)侵染活性測(cè)試確定轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度。與p24定量方法相比，NanoFCM可直接測(cè)定慢病毒的顆粒濃度，通過(guò)對(duì)莢膜內(nèi)p24蛋白的標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)p24陽(yáng)性的病毒顆粒的定量分析。進(jìn)一步通過(guò)核酸和VSV-G標(biāo)記，發(fā)展了對(duì)功能性慢病毒進(jìn)行快速定量分析的方法�；�于NanoFCM發(fā)展的慢病毒定量分析方法與轉(zhuǎn)導(dǎo)滴度的結(jié)果對(duì)比（如圖6），結(jié)果表明該慢病毒的particle-to-PFU ratio為100以上，針對(duì)p24蛋白的ELISA病毒滴度測(cè)定極易受游離p24蛋白的影響，相比之下NanoFCM所得結(jié)果與病毒的物理滴度更為吻合。
 

圖6. 慢病毒滴度測(cè)定