體外模型揭示免疫細(xì)胞亞型與人睪丸精原細(xì)胞瘤細(xì)胞系之間的相互作用

睪丸生殖細(xì)胞癌（TGCC）年輕男性中最常見的惡性腫瘤，病理學(xué)上主要分為精原細(xì)胞瘤（SGCT）與非精原細(xì)胞瘤（NSGCT）兩大類。SGCT 的特征尤其表現(xiàn)為由淋巴細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞組成的炎癥浸潤。單核/巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞是TGCC浸潤免疫細(xì)胞的大多數(shù)。這些腫瘤浸潤免疫細(xì)胞（TIICs）的作用以及它們是否有助于患者良好的總生存期（OS）的問題被廣泛未知。據(jù)研究，由各種免疫細(xì)胞類型、成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞組成的腫瘤微環(huán)境（TME）是精原細(xì)胞瘤“余燼性”表型的原因，或至少影響臨床結(jié)局。

由于沒有TGCC動物模型可用于研究免疫系統(tǒng)與腫瘤之間的相互作用，因此基于TGCC細(xì)胞系的體外系統(tǒng)是目前解決此問題的最佳選擇。Tcam-2細(xì)胞系與人精原細(xì)胞瘤細(xì)胞有許多共同特征，但根據(jù)微環(huán)境的不同，它們會轉(zhuǎn)化為類似于胚胎癌（EC）的表型。另據(jù)報道，TGCC中的TME本質(zhì)上是促炎的，在基于全外周血單核細(xì)胞（PBMC）與Tcam-2細(xì)胞共培養(yǎng)的體外模型中顯示，TME的細(xì)胞因子環(huán)境立即發(fā)生了變化。這些實(shí)驗(yàn)證實(shí)促炎細(xì)胞因子IL-6在睪丸癌中起重要作用，但PBMC中所含單個白細(xì)胞亞群的貢獻(xiàn)尚不清楚。

雖然免疫細(xì)胞對TGCC的影響是毋庸置疑的，但免疫細(xì)胞亞群與生殖細(xì)胞癌細(xì)胞之間的相互作用尚未詳細(xì)描述。目前尚不清楚TGCC中的腫瘤細(xì)胞是否對T細(xì)胞和單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生相似或相反的作用，也不知道免疫細(xì)胞是否也會相互改變腫瘤細(xì)胞的特征。為了解決這些問題，德國哥廷根大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的研究團(tuán)隊曾利用從不同健康供體的外周血中分離的T細(xì)胞和單核細(xì)胞進(jìn)行了共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，通過這種方法，可以獲得關(guān)于免疫相關(guān)機(jī)制的新見解，可能有助于TGCC患者精原細(xì)胞瘤的進(jìn)展。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Cells 題為“A Coculture Model Mimicking the Tumor Microenvironment Unveils Mutual Interactions between Immune Cell Subtypes and the Human Seminoma Cell Line TCam-2”。
眾所周知，腫瘤細(xì)胞能夠誘導(dǎo)免疫抑制性TME，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。然而，發(fā)現(xiàn)與腫瘤細(xì)胞接觸的免疫細(xì)胞被激活并引發(fā)炎癥反應(yīng)。為了在體外模型中解決這個問題，實(shí)驗(yàn)首先表征了與精原細(xì)胞瘤樣Tcam-2細(xì)胞系共培養(yǎng)后T細(xì)胞活性的變化，觀察到共培養(yǎng)中具有活化表型的高表達(dá)CD25的CD3+CD4+ T細(xì)胞亞群百分比增加。為了證實(shí)觀察結(jié)果，進(jìn)行了基因表達(dá)分析�？偟臄�(shù)據(jù)顯示，Tcam-2細(xì)胞誘導(dǎo)T細(xì)胞活化，從而促進(jìn)促炎TME。

一般而言，TME中的單核細(xì)胞傾向于采用抗炎M2表型并分化為所謂的腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）。為了表征TGCC細(xì)胞在TME中重編程單核細(xì)胞的能力，進(jìn)行了共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，與Tcam-2細(xì)胞共培養(yǎng)24小時的單核細(xì)胞表面CD25和CD163水平顯著升高，表明表型活化（圖1）。進(jìn)一步的分析表明，促炎M1標(biāo)志物IL1B和NOS2在共培養(yǎng)的單核細(xì)胞中強(qiáng)烈上調(diào)，而兩種抗炎M2標(biāo)志物ARG1和CD206則未改變甚至下調(diào)。趨化因子CCL2的基因表達(dá)也未見變化。這些結(jié)果表明，Tcam-2細(xì)胞有效地誘導(dǎo)單核細(xì)胞活化并極化為促炎M1表型。
  圖1    與TCam-2細(xì)胞共培養(yǎng)的外周血單核細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析。（A）單核細(xì)胞分析的示例性門控策略。（B）CD25（上）和CD163（下）在單獨(dú)培養(yǎng)（紅線）和與TCam-2細(xì)胞共培養(yǎng)（藍(lán)線）的單核細(xì)胞表面表達(dá)直方圖。（C）量化每種條件下CD25+ 單核細(xì)胞（上）或CD163（下）的平均熒光強(qiáng)度。

細(xì)胞因子在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起核心作用。先前的研究揭示了IL-6在睪丸癌中的關(guān)鍵參與以及TNFα在細(xì)胞凋亡、存活和炎癥方面的多功能性。接下來深入了解了這兩種細(xì)胞因子在Tcam-2細(xì)胞與單個免疫細(xì)胞亞型之間相互作用中的功能。在T細(xì)胞與Tcam-2細(xì)胞共培養(yǎng)中檢測到IL-6分泌，基因表達(dá)分析證實(shí)，T細(xì)胞而不是Tcam-2細(xì)胞是IL-6的主要來源，T細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中檢測不到TNFα。重要的是，在單核細(xì)胞與Tcam-2細(xì)胞共培養(yǎng)中觀察到大量IL-6 和TNFα分泌。這表明精原細(xì)胞瘤細(xì)胞對免疫細(xì)胞激活的反應(yīng)所建立的促炎環(huán)境由單核細(xì)胞衍生的介質(zhì)主導(dǎo)的�；�因表達(dá)分析證實(shí)，共培養(yǎng)中產(chǎn)生的兩種細(xì)胞因子主要來自活化的單核細(xì)胞，而不是Tcam-2細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明，免疫細(xì)胞受到精原細(xì)胞瘤細(xì)胞的刺激，從而可能促進(jìn)TME中的促炎狀況。

然后，為了研究免疫細(xì)胞是否對腫瘤細(xì)胞的表型可塑性有影響，分析了共培養(yǎng)的Tcam-2細(xì)胞中基因表達(dá)的變化。與T細(xì)胞共培養(yǎng)的Tcam-2細(xì)胞中觀察到EC標(biāo)記物SOX2和多能性標(biāo)記物NANOG和OCT2的mRNA水平顯著增加（圖2 A）。相反，無論是否存在T細(xì)胞，SOX17（精原細(xì)胞瘤細(xì)胞的標(biāo)志物）的mRNA水平在Tcam-2細(xì)胞中相似。有趣的是，單核細(xì)胞誘導(dǎo)的變化不那么明顯（圖2 B）。這一發(fā)現(xiàn)表明，單個免疫細(xì)胞亞群對TGCC細(xì)胞的干性有不同的影響，并且T細(xì)胞似乎特別介導(dǎo)從精原細(xì)胞瘤到胚胎癌表型的轉(zhuǎn)變。
  圖2    TCam-2細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)中多能性標(biāo)志物的基因表達(dá)分析。從與 T 細(xì)胞共培養(yǎng)（A）、與MC 共培養(yǎng)物（B）或單獨(dú)培養(yǎng)的TCam-2 細(xì)胞中收集的 TCam-2細(xì)胞中 SOX2、SOX17、OKT4和 NANOG 的相對 mRNA 水平表示為點(diǎn)圖。

考慮到已知TME會影響腫瘤行為，因此研究了參與增殖和細(xì)胞周期活性的關(guān)鍵基因。與T細(xì)胞共培養(yǎng)的Tcam-2細(xì)胞中的KI67和MCM3 mRNA水平顯著上調(diào)，這表明T細(xì)胞可能能夠刺激腫瘤生長（圖3）。此外，在成人TGCC中高表達(dá)的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子CDK4、與轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因VEGFA的mRNA水平在與T細(xì)胞共培養(yǎng)的Tcam-2細(xì)胞中均上調(diào)（圖3 A），這表明T細(xì)胞可能增加精原細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲性（圖3 A）。同樣，單核細(xì)胞對Tcam-2細(xì)胞的影響要小得多，甚至似乎減少了增殖（圖3 B）。這些數(shù)據(jù)表明，精原細(xì)胞瘤中的T細(xì)胞浸潤可能促進(jìn)其增殖，因此TME中免疫細(xì)胞的組成可能會影響腫瘤的預(yù)后。

最后，實(shí)驗(yàn)開始測試觀察到的KI67，MCM3和CDK4表達(dá)的差異是否導(dǎo)致細(xì)胞生長的可測量變化。與增殖活性標(biāo)記基因的mRNA水平增加一致，與單獨(dú)培養(yǎng)的TCam-2細(xì)胞相比，與T細(xì)胞共培養(yǎng)的TCam-2細(xì)胞數(shù)量增加15%。實(shí)驗(yàn)觀察到的細(xì)胞數(shù)量增加支持以上結(jié)論，即TIIC影響腫瘤生長。
  圖3    分析TCam-2細(xì)胞與免疫細(xì)胞共培養(yǎng)中增殖和轉(zhuǎn)移潛能標(biāo)志物的基因表達(dá)。從 與T 細(xì)胞共培養(yǎng)（A）、與MC 共培養(yǎng)（B）或單獨(dú)培養(yǎng)的TCam-2細(xì)胞中收集的 TCam-2 細(xì)胞中 KI67、MCM3、CDK4和 VEGFA 的相對 mRNA 水平表示為點(diǎn)圖。

在這項(xiàng)研究中，該團(tuán)隊在體外共培養(yǎng)模型中表征了純化的免疫細(xì)胞亞型與精原細(xì)胞瘤細(xì)胞的相互作用。首次能夠證明精原細(xì)胞瘤細(xì)胞能夠通過激活T細(xì)胞和單核細(xì)胞來誘導(dǎo)強(qiáng)烈的促炎性TME。相反，精原細(xì)胞瘤的增殖和可能的轉(zhuǎn)移潛力受到T細(xì)胞的影響，這也引發(fā)了表型轉(zhuǎn)變?yōu)槿シ只疎C樣命運(yùn)。這些結(jié)果清楚地表明，單個免疫細(xì)胞亞型在精原細(xì)胞瘤TME的體外模型中發(fā)揮選擇性作用，并在決定這種腫瘤實(shí)體的行為和命運(yùn)中揭示了它們的特定作用。

參考文獻(xiàn)：Gayer FA, Fichtner A, Legler TJ, Reichardt HM. A Coculture Model Mimicking the Tumor Microenvironment Unveils Mutual Interactions between Immune Cell Subtypes and the Human Seminoma Cell Line TCam-2. Cells. 2022 Mar 4;11(5):885. doi: 10.3390/cells11050885. PMID: 35269507; PMCID: PMC8909655.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35269507/
Impact Factor: 6.0 (2022); 5-Year Impact Factor: 6.7 (2022)
ISSN: 2073-4409

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