ApogeeMix流式微球金標準在外泌體流式分析結果準確的應用

細胞外囊泡和外泌體的流式檢測方法已經(jīng)逐漸流行起來，因為流式細胞儀不僅可以檢測囊泡的大小、數(shù)量，而且通過細胞特異的標記物染色可以檢測囊泡的來源，將囊泡進行分類，因此，流式細胞儀理論上是進行囊泡快速、高通量、多參數(shù)檢測的最優(yōu)選擇。

 

利用流式細胞儀進行細胞外囊泡檢測往往需要使用標準微球（microspheres）來校正和設門（SetGate），常用的微球材料有聚苯乙（）烯（Polystyrene）和二氧化硅（silica），國際血栓與止血協(xié)會和標準化委員會（ISTH SSC）推薦用于循環(huán)微粒（微囊泡）檢測設門的Megamix就是聚苯乙（）烯微球。但是，最近越來越多的研究人員發(fā)現(xiàn)，用標準微球進行設門存在很嚴重的偏差，因為不同材料的微球的折射率（refractive index）是不一樣的，相同直徑的微球，折射率越大產(chǎn)生的散射光就越強。而且微球的折射率要遠遠大于生物囊泡的折射率，意味著微球產(chǎn)生的散射光強度是相同直徑囊泡的幾十倍。實際上，0.5mm聚苯乙（）烯微球（Megamix）產(chǎn)生的散射光強度相當于1.4mm的囊泡，而2.7mm的囊泡才能產(chǎn)生跟0.9mm聚苯乙（）烯微球（Megamix）相當強度的散射光（表1）[1]。因此，如果我們用0.5mm的聚苯乙（）烯微球（Megamix）設門來檢測小于0.5mm的細胞外囊泡將產(chǎn)生嚴重的偏差，檢測結果也是不可信的。而二氧化硅的折射率更接近于生物囊泡的折射率，因此二氧化硅微珠可以作為較好的參考粒子。

 

*FSRI, forward scatter relative intensity measured on the Apogee A40. **Diameter of a lipid or cellular microparticle with the same forward scatter relative intensity as the particle that was measured. Equivalent microparticle diameter (mm) = 3.2911(PD) - 0.2768, where PD = polystyrene microsphere diameter (mm).

 

英國Apogee Flow公司的ApogeeMix (Cat #1493)標準微球是一種非常成熟易用的混合標準微球：包括熒光標記的乳膠微球和無熒光標記的二氧化硅標準微球，粒徑范圍涵蓋110nm到1300nm之間不同大小的標準微球。這種混合標準微球不僅可提供簡便的方法來評估流式細胞儀散射光和熒光的靈敏度及分辨率，同時，內(nèi)含多種不同大小的納米級二氧化硅標準微球，更是可以更接近生物樣品折射率的折射率（1.43）對流式細胞儀進行散射光校準，現(xiàn)已成為微小生物納米顆粒流式分析的金標準參考微球。

 

ApogeeMix標準微球組成：

25ml的混合標準微球溶液，內(nèi)含折射率ɳ=1.43，直徑分別為180nm、240nm、300nm、590nm、880nm和1300nm的二氧化硅標準微球，以及折射率ɳ=1.59，直徑分別為110nm和500nm的488激光激發(fā)的綠色熒光標記乳膠微球。該產(chǎn)品可以很好地用于評估流式細胞儀散射光和熒光的分析性能（靈敏度和分辨率）。下圖1是在Apogee A50-Micro流式細胞儀上分析的ApogeeMix典型數(shù)據(jù)（FL1=綠色熒光）。

 

綠色熒光標記的乳膠微球可用于評估流式細胞儀熒光靈敏度和不同折射率背景下的光學分析性能。

圖1：不同大小標準微球在峰形圖中的分辨率可很好地展現(xiàn)流式細胞儀的分析性能。理想情況下，8種不同大小的標準微球峰形群應相互分離，并可與儀器噪聲明顯區(qū)分開：

6種大小，折射率為1.43的二氧化硅微球和2種大�。�110nm和500nm），折射率為1.59的綠色熒光乳膠微球（488nm激光激發(fā)）（中間圖）。

 

為了更精確地檢測生物囊泡大小（折射率通常在1.36到1.40之間），英國Apogee納米流式細胞儀的工程師們研發(fā)了專利的折射率校正功能，無論是單參數(shù)的柱狀圖（Histogram）還是雙參數(shù)的散點圖（Cytogram），只要單擊右鍵選擇“Choose Calibration Scale”就會出現(xiàn)一條校正大小的標尺，并且可以根據(jù)檢測樣本的折射率來選擇相應折射率的標尺（圖2），那么我們就可以根據(jù)樣本的直徑大小和折射率這兩個參數(shù)來設門和選擇我們感興趣的區(qū)域（region of interest, ROI），得到真實可靠的結果。

圖2.折射率分別為1.38和1.42的微粒（180, 240,300 ,590, 880, 1300, 2000nm）在散點圖中的位置。

 

那么市面上的流式細胞儀是否都適合進行細胞外囊泡和外泌體的檢測？

 

首先，細胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）直徑從40nm到1000nm不等，胞外囊泡直徑約為100nm–1000nm，外泌體直徑約為40nm - 100nm。對傳統(tǒng)的流式細胞儀來說，散射光的檢測極限通常是300-500nm，無法將大多數(shù)細胞外囊泡與背景噪音區(qū)分，直徑小于300nm的細胞外囊泡很難被檢測到[2]。

 

其次，我們來看一組流式細胞儀散射光技術對比：

圖 3. Technological improvement in forward scatter (FS) for microparticle (MP) measurement: (A) Beads resolution improvement: FS distribution of a blend of fluorescent latex beads (0.1/0.14, 0.3, 0.5 and 0.9 μm) with a threshold on fluorescence. (B) Background noise reduction: Scatters dot plot showing blue (0.9 μm beads), red (0.5 μm beads), green (0.3 μm beads) and violet (0.1/0.14 μm beads) beads with a FS threshold. Grey dots are background noise.

 

圖3展示的是Apogee納米流式細胞儀A50-Micro與其它流式細胞儀（F50、Gallios、Influx）的技術對比[2]，通過前向角散射光FC500只能勉強區(qū)分0.5μm和0.9μm的微珠，0.5μm以下的微珠則完全無法區(qū)分；Gallios和Influx在散射光檢測能力方面有所提高，可以區(qū)分0.3μm和0.5μm的微珠，但0.3μm以下的微珠還是無法區(qū)分；而Apogee A50-Micro可以輕松地將0.14μm的微珠和0.3μm的微珠分成兩個群（Fig 1.A）。從前向角散射光和側向角散射光的散點圖中可以看到，無論是FC500還是Gallios或Influx都只能部分的將0.3μm的微珠與背景噪音區(qū)分開，而A50-Micro可以清晰地將0.3μm的微珠與背景噪音完全區(qū)分開（Fig1.B中綠色數(shù)據(jù)點），并且只有A50-Micro可以檢測到0.14μm的微珠（Fig1.B中紫色數(shù)據(jù)點）。

 

這些結果充分說明Apogee納米流式細胞儀在檢測微小顆粒的優(yōu)越性。利用Apogee A50-Micro突出的高靈敏度和分辨率（10nm），我們可以輕松地將直徑相差10nm以上的細胞外囊泡樣本進行分群、計數(shù)、分析。另外，多達9通道熒光檢測器，可以靈活使用細胞外囊泡特定抗原熒光抗體進行快速、高通量、多參數(shù)檢測囊泡來源和精確數(shù)量分析。

 

另外，由于外泌體（exosomes）的直徑特別�。�40 - 100nm），超出了傳統(tǒng)流式細胞儀的檢測范圍，為此，很多公司提供了特異抗體標記的微珠用于外泌體的富集和流式分析，但這種方法的局限是操作復雜，對抗體特異性要求很高，而且無法知道外泌體的數(shù)量。而Apogee納米流式細胞儀超高的靈敏度和分辨率使其可以直接對樣本中的外泌體進行分析和計數(shù)，操作簡單，結果準確。美國個性化醫(yī)療的領軍生物技術公司Caris Life Sciences正是利用A50-Micro來檢測和分析復雜病人樣本中的微囊泡和外泌體[3]。

 

如果沒有Apogee納米流式細胞儀，不妨先選擇試試ApogeeMix標準微球，讓你的外泌體流式分析結果更準確！

 

[1] Chandler WL, Yeung W, Tait JF. A new microparticle size calibration standard for use in measuring smaller microparticles using a new flow cytometer. J Thromb Haemost. 2011 Jun;9(6):1216-24.

[2] Lacroix R, Robert S, Poncelet P, Dignat-George F. Overcoming limitations of microparticle measurement by flow cytometry. Semin Thromb Hemost. 2010 Nov;36(8):807-18.

[3] Abstracts from the Third International Meeting of ISEV 2014. Rotterdam, The Netherlands, April 30th – May 3rd, 2014. J Extracell Vesicles. 2014; 3:24214.

 

 

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