嗜粘蛋白阿克曼菌來源的新型三肽RKH對致命膿毒癥的保護作用

研究結果
1. 腸道微生物AKK在小鼠敗血癥模型中具有保護作用
通過CLP造模小鼠的糞便微生物基因組測序分析發(fā)現，AKK在CLP敗血癥模型中顯著降低（Fig 1a），PCR驗證了測序實驗結果（Fig 1b）。臨床敗血癥患者的大規(guī)模驗證中，AKK豐度顯著降低（Fig 1c）。將敗血癥患者分為AKK高和低兩組，16S-seq也證實了相同的結果（Fig 1d）。

給CLP造模小鼠接受AKK治療后，AKK給藥豐度高的小鼠生存率顯著高于AKK豐度低的小鼠（Fig 1e）。采用CLP手術誘導敗血癥后，分別給予PBS、活AKK、加熱滅活AKK治療，在活AKK組小鼠生存率遠高于PBS和滅活AKK組（Fig 1f），且活AKK組，小鼠肺和肝臟炎癥反應顯著降低（Fig 1g-h）。接著使用AKK培養(yǎng)基上清治療CLP敗血癥小鼠，小鼠的生存率、炎癥程度、肺和肝臟的功能均有所恢復（Fig 1i-k）。

接著采用LPS誘導的小鼠敗血癥模型，也證實了活的AKK治療及AKK上清均能改善小鼠生存，緩解肺和肝臟損傷（Fig 1l-o）。本次實驗證實活的AKK能有效緩解。
 

2. AKK產生RKH保護小鼠免受致死性敗血癥損傷
為了進一步探究AKK的保護機制，作者采用非靶向代謝組學對AKK上清和空白培養(yǎng)基進行了主成分分析（Fig 2a）和差異代謝物分析（Fig 2b），發(fā)現RKH在AKK上清中差異最明顯（Fig 2b-c），且代謝物通路分析也發(fā)現RHK代謝通路顯著富集（Fig 2d）。靶向代謝組學證實了RKH在AKK上清中顯著上升（Fig 2e）。采用無菌鼠定植方法，活AKK定植組的RHK水平顯著上升（Fig 2f-g）。在敗血癥患者糞便中，RKH水平顯著降低（Fig 2h）。

接著，作者在CLP造模前先給與小鼠RKH處理，生存分析發(fā)現RKH處理小鼠的生存率顯著升高（Fig 2i）。小鼠器官（包括肺、肝臟、腎臟和心臟）免疫組化發(fā)現，RKH前處理小鼠的炎癥水平降低（Fig 2j），血漿丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、肌酸激酶（CK）、肌酸酐和尿素水平降低（Fig 2k）。且小鼠器官（包括肺、肝臟、腎臟和心臟）中的炎癥基因表達降低（Fig 2l）。在LPS誘導的敗血癥模型中也發(fā)現了相同現象（Fig 2n-o）。結果證實，AKK產生RKH保護小鼠免受敗血癥致死性損傷。
 

Fig. 2 活AKK產生的RKH對小鼠致命敗血癥具有保護作用

3. RKH抑制敗血癥引起的系統性炎癥
作者采用RKH處理后的敗血癥小鼠腹腔液進行RNA-seq，主成分分析發(fā)現RKH處理后，表達譜顯著變化（Fig 3a），尤其是炎癥相關基因（Fig 3b）。RT-qPCR、ELISA實驗證實活AKK處理后，小鼠血漿和腹腔液中細胞因子豐度顯著降低（Fig 3c），AKK上清液和RKH處理均呈現相同結果（Fig 3d-e）。

前期研究發(fā)現，巨噬細胞激活在敗血癥早期的細胞因子風暴中發(fā)揮了重要作用，通過流式，作者也發(fā)現敗血癥小鼠外周血中的巨噬細胞占比顯著升高（Fig 3f），而活AKK治療活RKH治療均能顯著降低敗血癥小鼠外周血中的巨噬細胞水平（Fig 3g）。體外實驗證實RKH通過抑制促炎因子生成，而非誘導細胞毒性發(fā)揮系統性炎癥的抑制作用（Fig 3h）。
 

Fig. 3 RKH預防敗血癥引起的全身炎癥

4. RKH靶向TLR抑制TLR激活
TLR在系統性炎癥的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。作者發(fā)現RKH顯著降低TLR4信號通路下游蛋白（Fig 4a-b）。RKH顯著減少LPS與TLR4的互作（Fig 4c），表面等離子共振分析發(fā)現，RKH可以直接結合TLR4（Fig 4d），增強TLR4的抗蛋白酶水解能力（Fig 4e），導致TLR4豐度升高（Fig 4f）。

IP實驗發(fā)現，RKH可以與LPS競爭性結合TLR4（Fig 4g-h），提示RKH可能抑制TLR4活性。采用分子對接分析發(fā)現，RKH可以與TLR4/MD2結合口袋互作（Fig 4i）。突變TLR4的結合口袋后，RKH與TLR4的結合能力顯著降低（Fig 4j）。

在TLR4敲除的CLP造模小鼠中，RKH處理與對照相比，小鼠生存率沒有顯著變化（Fig 4k）。小鼠肺病理變化、血漿炎癥因子水平、肺和肝臟功能均有所改善（Fig 4l-o）。這些結果證實，RKH抑制敗血癥進展，在一定程度上，是通過抑制TLR4通路發(fā)揮調節(jié)作用。
 

Fig. 4 RKH直接靶向TLR4受體并阻斷TLR4激活

5. RKH降低敗血癥仔豬模型的高炎癥反應
作者構建了敗血癥仔豬模型（Fig 5a），并發(fā)現RKH治療可改善仔豬的生存時間（Fig 5b）。仔豬血清中AST、γ-谷氨酰轉肽酶和乳酸脫氫酶、尿素、IL-6、IL-1β豐度均顯著降低（Fig 5c）。組織病理學也發(fā)現仔豬多種器官中的促炎因子表達顯著下降（Fig 5d-g）。綜上所述，RKH可以降低敗血癥誘導的死亡率，并改善仔豬模型中的全身炎癥和器官損傷。
 

Fig. 5 RKH延長膿毒癥仔豬模型的存活時間并減少過度炎癥和器官損傷

6. RKH負調控膿毒癥患者巨噬細胞的促炎活性
分離敗血癥患者外周血中的巨噬細胞，LPS刺激后，在RKH處理組IL-6豐度明顯降低（Fig 6A）。分離外周血CD4+和CD8+ T細胞（Fig 6b），激活或未激活，RKH處理不改變T細胞凋亡程度（Fig 6c-d），也不改變T細胞分泌細胞因子能力（Fig 6e-f）。這些結果證實，RKH通過負調控巨噬細胞的促炎活性，改善敗血癥患者的身體狀況，而非影響T細胞的功能。
 

Fig. 6 RKH負調控膿毒癥患者巨噬細胞的促炎活性

文章結論
文章提供了敗血癥發(fā)展過程中宿主-微生物組相互作用的新證據。通過揭示活AKK產生的一種新的生物活性三肽RKH，解析了活AKK的病理生理作用。對處于高炎癥狀態(tài)的患者，RKH可能是致命敗血癥的潛在有效治療方法。

參考文獻：
Xie S, Li J, Lyu F, Xiong Q, Gu P, Chen Y, Chen M, Bao J, Zhang X, Wei R, Deng Y, Wang H, Zeng Z, Chen Z, Deng Y, Lian Z, Zhao J, Gong W, Chen Y, Liu KX, Duan Y, Jiang Y, Zhou HW, Chen P. Novel tripeptide RKH derived from Akkermansia muciniphila protects against lethal sepsis. Gut. 2023 Aug 8:gutjnl-2023-329996. doi: 10.1136/gutjnl-2023-329996. Epub ahead of print. PMID: 37553229.