使用小型切向流過(guò)濾 (TFF) 系統(tǒng)對(duì)于樣品濃縮和緩沖液交換的實(shí)際意義

無(wú)論是用于結(jié)構(gòu)生物學(xué)還是一般生物化學(xué)需求，蛋白質(zhì)濃縮和緩沖液交換步驟對(duì)于任何制備規(guī)模的蛋白質(zhì)生產(chǎn)都是不可或缺的。這些步驟在純化實(shí)驗(yàn)方案結(jié)束時(shí)必須至少完成一次，甚至在不同的色譜步驟之間必須至少完成一次，因而這會(huì)大大增加實(shí)驗(yàn)時(shí)間。
 
當(dāng)前方法
超濾是目前濃縮蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)，而在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模上，超濾通常涉及一次性離心機(jī)驅(qū)動(dòng)設(shè)備。這些設(shè)備本質(zhì)上是死角（流動(dòng)垂直于膜）并在膜處產(chǎn)生濃度梯度。膜處的濃度可能遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)目標(biāo)，從而減慢濾液的流動(dòng)并由于聚集/沉淀而增加材料損失。監(jiān)測(cè)濃縮過(guò)程或混合樣品的唯一方法是定期中斷離心，這讓此成為一種相當(dāng)實(shí)用的方法。
 
膜透析是最流行的緩沖液交換方法，而且這種方法與由滲透壓驅(qū)動(dòng)的截留分子量膜有關(guān)。雖然它是一種無(wú)需人工干預(yù)的方法，但它需要大量過(guò)剩的透析緩沖液、較長(zhǎng)的透析時(shí)間（8-12 小時(shí)）以及隨后要進(jìn)行濃縮步驟。
 
在工業(yè)規(guī)模上，緩沖液交換和濃縮均通過(guò)采用切向流過(guò)濾 (TFF) 的單個(gè)設(shè)備完成。除了濾液滲過(guò)膜外，TFF 系統(tǒng)還將有一個(gè)與膜平行（或切向）的主動(dòng)流。這種流實(shí)時(shí)混合樣品（截留物），如果將所需緩沖液添加到滲余物中，則會(huì)顯著降低濃度梯度并能實(shí)現(xiàn)過(guò)濾器透析（滲濾）。然而，即使對(duì)于死體積為數(shù)十到數(shù)百毫升的最小 TFF 設(shè)備，其也不適合典型的實(shí)驗(yàn)室工作流程。
 
µPULSE TFF 系統(tǒng)

在這里，我們展示了我們的小型 TFF 系統(tǒng)，它是同類(lèi)產(chǎn)品中最小的設(shè)備之一，專(zhuān)門(mén)用于實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的純化實(shí)驗(yàn)。它有著低于 1 毫升的完全可回收死體積，如果進(jìn)行滲濾，一次可容納高達(dá) 50 mL 的體積，如果僅進(jìn)行濃縮，則一次最高可容納 100 mL。與 可容納 15 mL 的離心設(shè)備相比，µPULSE TFF 系統(tǒng)的超濾速度最高可提高 5 倍，并且通過(guò)非接觸式液體傳感完全自動(dòng)化，能夠把截留物體積降至指定的設(shè)定值。
 
µPULSE TFF 系統(tǒng)具有一個(gè)可消耗的替換盒，該盒包含了一個(gè)微流體泵和一個(gè)比典型的 15 mL 離心裝置稍大的膜（~7.1 cm^2 vs 12.4 cm^2 ），以實(shí)現(xiàn)更快的樣品濃縮。
   
注意：
* 實(shí)驗(yàn)使用的是 1 mg/mL BSA
** FORMULATRIX® 膜尺寸比 Amicon 大 60%
*** 通過(guò)用蛋白質(zhì)溶液填充兩個(gè)離心管，容納體積可能達(dá)到 100 mL
 
使用 TFF 更快地濃縮樣品
與使用傳統(tǒng)死端過(guò)濾的離心機(jī)不同,μPULSE 可防止在過(guò)濾膜上形成高濃度梯度。這意味著滲透流速?zèng)]有降低并且樣品回收率提高了。使用 TFF,濃縮過(guò)程是連續(xù)和漸進(jìn)的,使得樣品的濃縮速度比使用死端過(guò)濾的離心機(jī)快 5 倍以上。
 
與使用傳統(tǒng)的死端過(guò)濾的離心機(jī)相比，µPULSE TFF 系統(tǒng)使用更大的過(guò)濾膜（約大 60%）。這種更大的膜具有更高的膜通量,讓用戶(hù)可以更快地濃縮樣品,以便繼續(xù)進(jìn)行其他研究。
 
簡(jiǎn)單滲濾（緩沖液交換、脫鹽）
除了濃縮樣品,還可以選擇自動(dòng)滲濾以促進(jìn)緩沖液交換或脫鹽過(guò)程。設(shè)置簡(jiǎn)單:系統(tǒng)前端有兩個(gè)50mL離心管：一管放樣品溶液，另一管放緩沖液或其他所需溶液。該系統(tǒng)可以設(shè)置為連續(xù)滲濾模式或設(shè)置為離散滲濾步驟。用戶(hù)可以通過(guò)基于網(wǎng)頁(yè)的軟件應(yīng)用程序監(jiān)控滲濾的狀態(tài)。
 
使用一次性過(guò)濾芯片易于維護(hù)
μPULSE - TFF 系統(tǒng)使用一次性過(guò)濾芯片,便于保持系統(tǒng)清潔并防止交叉污染。內(nèi)置隔膜泵在真空(-10-0 psi)和壓力(40-50 psi)之問(wèn)切換,使溶液在濃縮膜上循環(huán)。同時(shí)加壓芯片和滲濾液體收集罐(15-20 psi) 以幫助強(qiáng)制滲透并加速該過(guò)程。提供四種不同濃度的 PES(聚醚砜)膜,截留分子量分別為 10kDa、 30 kDa、 50kDa和100kDa，以覆蓋各種蛋白尺寸。
  可重復(fù)使用性和高效能
PULSE TFF 的耗材可以多次重復(fù)使用，效能幾乎沒(méi)有損失。在標(biāo)準(zhǔn)離心過(guò)濾器的濃縮率呈指數(shù)衰減的情況下，PULSE TFF 的耗材能夠以穩(wěn)定的速度完成濃縮，只有在達(dá)到極高濃度時(shí)速度才會(huì)減慢。
 
即使在濃縮比截留分子量大 6 倍的蛋白質(zhì)時(shí)，PULSE TFF 耗材的性能也優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)離心管數(shù)倍，在需要重新更換前能輕松濃縮 5-10 倍的溶液。  
注意：
*實(shí)驗(yàn)使用的是 1mg/mL BSA (~66kDa)
**實(shí)驗(yàn)使用的是 1mg/mL 細(xì)胞色素 c (~12kDa)