南極假絲酵母脂肪酶B在畢赤酵母中的高效表達在生物柴油生產中的應用
生物柴油，又稱脂肪酸甲酯(FAMEs)，通常由非食用油與甲醇酯化或酯交換反應而得。在眾多的生產方法中，脂肪酶催化生產生物柴油因其選擇性高、反應條件溫和、下游加工簡單等優(yōu)點，無疑是最有前景的方法之一。脂肪酶(EC 3.1.1.3，三�；视王ニ饷�)可進行催化水解、酯化和酯交換反應，多應用于食品、制藥和能源等行業(yè)。
來自南極假絲酵母的脂肪酶B (CALB)由于具有多種生物催化用途，是目前研究和應用最廣泛的脂肪酶之一。然而，原始CALB的酶活性通常較低，并且從南極假絲酵母中生產CALB的成本也很高，因此，通常需要通過基因工程來異源表達制備重組CALB。
南京林業(yè)大學的王飛教授團隊近期在《Applied Biochemistry and Biotechnology》中發(fā)表了相關研究“Efficient Expression of Candida antarctica Lipase B in Pichia pastoris and Its Application in Biodiesel Production”。在此項研究中，科研人員分別進行了7個啟動子和5個信號肽在畢赤酵母中表達CALB的密碼子優(yōu)化對比，然后在最佳組合條件下，用高濃度抗生素篩選得到含有3個CALB基因拷貝的重組畢赤酵母。最終使用1.3 L生物反應器(迪必爾生物)，發(fā)酵培養(yǎng)約9天后獲得的CALB活性和總蛋白含量分別達到444.46±18.81U/mL和5.41±0.1g/L，分別是初始菌株的34倍和20倍。此外，所獲得的CALB還用于催化酸化地溝油與甲醇的酯交換反應，這為利用重組CALB作為催化劑將含有大量游離脂肪酸的廢棄或低質量生物油原料轉化為生物柴油提供了一條很有前景的途徑。
研究結果可為酵母中CALB的高效表達和提高脂肪酶產量提供參考，同時也為其他有價值蛋白質的生物生產帶來新的可能性。
主要研究路線
#1 CALB表達質粒及重組菌株的構建及篩選
研究人員從南極假絲酵母中克隆擴增出WT-CALB基因，并以pPICZαA為載體構建出pPICZαA-WT-CALB，同時選擇兩個突變位點(V210I/A281E)進行密碼子優(yōu)化。將優(yōu)化后的基因插入pPICZαA的EcoR I和Kpn I酶切位點之間，主要有誘導啟動子PAOX1，組成啟動子PGCW14, the PPDC, PPYK, PP9，甲醇誘導啟動子PFLD1，PAOX1d1+201七種啟動子。同時，人工合成4種信號肽mα, MFΔ, SP23, pre-Ost1-pro-αMF來調控CALB的表達合成。
對重組質粒進行線性化處理，并通過電轉的方式轉入感受態(tài)畢赤酵母中。隨后在30℃條件下孵育1-2小時，轉移至篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)3-4天，最終鑒定篩選出所需的重組菌株進行下一步的搖瓶實驗。
#2 工程菌株在搖瓶上進行相應培養(yǎng)
將攜帶有CALB基因的陽性工程菌株接種于含有2mL YPD培養(yǎng)基的20mL搖管中，30℃，250rpm條件下培養(yǎng)過夜，隨后更換培養(yǎng)基為BMGY。為了在組成型啟動子（PGCW14, the PPDC, PPYK, PP9）的調控下表達CALB，以初始OD600值為1.0的密度將畢赤酵母接種于250mL的搖瓶中。為了在甲醇誘導啟動子（PFLD1，PAOX1d1+201）下表達CALB，將酵母細胞接種于含有25mL BMGY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，生長約12-16 h后離心，重懸于含有50mL BMMY培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，初始OD600值為1.0。每24 h向BMMY培養(yǎng)基中加入0.5% (v/v)甲醇。每24 h收獲1毫升培養(yǎng)物，進行蛋白質濃度和酶活性測定。
如圖1所示，PGCW14相對于PAOX1表現(xiàn)出更強的啟動子能力，選擇PGCW14后，CALB的活性增加約29%，蛋白濃度增加至0.27±0.01 g/L。如圖2所示，所有信號肽的分泌能力均高于αMF信號肽。其中，Mα信號肽的活性最高，可使CALB活性提高46%。SP23、MFΔ和pre-Ost1-pro-αMF信號肽分別使CALB活性升高約41%、29%和35%。此外，Bradford法顯示，各信號肽下CALB蛋白濃度均升高，其中Mα信號肽使CALB表達量升高至0.36±0.02 g/L。
圖1. 不同啟動子控制下表達的脂肪酶活性比較。不同字母表示差異顯著(p<0.05)。
圖2. 不同信號肽控制轉化代表的脂肪酶活性比較。不同字母表示差異顯著(p<0.05)
同時研究人員考慮了不同基因拷貝數(shù)對于CALB表達分泌的影響，使用含有高濃度博來霉素的YPFS板來篩選具有多重整合的菌株，最終獲得了幾個多拷貝克隆，最大拷貝數(shù)為4。表1顯示CALB的活性隨著基因劑量的增加而增加。然而，四拷貝菌株的活性不如三拷貝菌株。這表明基因劑量存在平臺效應。三拷貝菌株的CALB活性約為28.69±0.99 U/mL，比原菌株的CALB活性提高約124%。然而，分泌CALB的產生似乎并不隨著基因劑量的增加而增加。多拷貝菌株與低拷貝菌株的分泌蛋白產量無顯著差異。研究人員表示這是可能的，過量的蛋白質造成細胞負荷，導致蛋白質沉積在細胞中。然而，CALB基因的引入似乎對宿主的生長沒有任何影響，這需要進一步分析。
表1. CALB不同拷貝數(shù)重組菌株脂肪酶表達情況比較
#3 重組菌株在生物反應器上進行培養(yǎng)
所有補料分批發(fā)酵均在生物反應器(迪必爾生物）中進行，該反應器可控制4個發(fā)酵罐同時運行�？蒲腥藛T選擇上面提到的CALB三拷貝重組菌株作為工作菌株，以10% (v/v)接種量接種于含有0.6 L培養(yǎng)基的1.3 L發(fā)酵罐中。初始溫度設定為30℃，當酵母細胞OD600達到200左右時，將溫度調整到20℃。pH值設置為5.5，通過加入25% (v/v)的氫氧化銨或30% (v/v)的H3PO4調節(jié)pH值。在整個發(fā)酵過程中，通過控制攪拌和通氣，將DO控制在20-30%左右。以DO突然升高作為甘油耗盡的表現(xiàn)，補加500 g/L (w/v)甘油，并添加1.2% (v/v) PTM1。每12 h收集發(fā)酵液，分析OD600、總蛋白含量和脂肪酶活性。
圖3為重組菌株在BSM培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況。在10天的發(fā)酵過程中，OD600值最高可達1600，干細胞重超過400 g/L，真正實現(xiàn)了高密度發(fā)酵。培養(yǎng)約9 d后，CALB活性和蛋白質含量最高，分別達到438.16±2.41 U/mL和4.05±0.1 g/L。酶活性和蛋白質含量分別比處理前提高了34.23倍和20.25倍�？紤]到生物反應器中菌株死亡導致發(fā)酵液中殘留蛋白的存在，CALB的比活性可能會進一步增強。此外，在相同條件下，科研人員將所得的CALB與市售CALB進行了比較。結果表明，脂酶CALB的活性約為380 U/mL，表明發(fā)酵罐中產生的CALB活性與市售酶相當。
圖3. CALB重組菌株在BSM培養(yǎng)基中的發(fā)酵圖譜
圖4為重組菌株在FM22培養(yǎng)基中的發(fā)酵情況。發(fā)酵過程與BSM培養(yǎng)基基本相同，酶活性最高為444.46±18.81 U/mL，比原菌株提高了34.72倍。值得注意的是，盡管存在其他蛋白質雜質，但在FM22培養(yǎng)基中產生的總蛋白質含量達到5.41±0.1 g/L，比原菌株增加了27.05倍。FM22培養(yǎng)基的成分與BSM相似，是酵母發(fā)酵的常用培養(yǎng)基之一。而FM22介質不含磷酸，不需要加入大量的氨溶液來調節(jié)pH值，易于操作。因此，可以考慮使用FM22培養(yǎng)基制備接種物。
圖4. CALB重組菌株在FM22培養(yǎng)基中的發(fā)酵圖譜
#4 重組CALB催化地溝油制備生物柴油
科研人員通過實驗確定了重組CALB催化地溝油制備生物柴油的最佳工藝條件為:甲醇/油比5:1，酶投加量20 U/g油，水含量(V/V) 20%，反應溫度30℃。在此條件下反應60 h后，生物柴油的產率為66.54±0.11%，成功完成了從地溝油向生物柴油的轉化，為利用重組CALB作為催化劑將含有大量游離脂肪酸的廢棄或低質量生物油原料轉化為生物柴油提供了一條極具前景的途徑
參考文獻：Xiao, D. , Li, X. , Zhang, Y. , & Wang, F. . (2023). Efficient expression of candida antarctica lipase b in pichia pastoris and its application in biodiesel production. Applied biochemistry and biotechnology.
文獻中提到的1.3L生物反應器是來自迪必爾生物的Minibox 5平行生物反應器（圖5）。迪必爾平行生物反應器從最初的minibox 1到minibox 5，再到2021年推出第6代產品——CloudReady™云平臺生物反應器，一直致力于協(xié)助合成生物學領域科學家進行科研與創(chuàng)新。
圖5. Minibox 5 第5代平行生物反應器
CloudReady™云平臺生物反應器（圖6）整合了多種補料策略，同時內置DoE實驗設計與分析軟件可以幫助用戶快速的進行布局實驗，縮短產品的開發(fā)周期。
圖6. CloudReady™ 第6代平行生物反應器
