密度梯度離心法分離PBMC原理及實驗步驟

從外周血、骨髓、外周淋巴器官或各種組織分離出來的細胞是多種細胞的混合物。如要研究某種特定細胞的結構、功能或表面標志等特征，首先要分離純化細胞。細胞分離可根據其大小、密度、表面電荷、吸附能力或表面抗原的差異而采用密度梯度沉降法、貼附、親和層析、化環(huán)形成、補體介導殺傷溶解、免疫磁珠以及流式細胞儀（FCM）等方法來進行純化。

一．Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC原理

常用來分離人外周血單個核細胞（PBMC）的分層液比重是1.077 ± 0.001 kg/L的聚蔗糖（Ficoll）-泛影葡胺（Urografn）（F /H）分層液。Ficoll是蔗糖的多聚體，呈中性，親水性高，平均分子量為400000。當密度為1.2 g/ml仍未超出止常生理性滲透壓，也不透過生物膜。紅細胞、粒細胞比重大，離心后沉于管底；淋巴細胞和單核細胞的比重小于分層液比重，離心后漂浮于分層液的液面上，也可有少部分細胞懸浮在分層液中，吸取分層液液面的細胞，就可從外周血中分離到單個核細胞。
 

圖1 PBMC分離示意圖

二．PBMC分離的實驗步驟

1.在短中管中加入適量淋巴細胞分離液。
2.取肝素抗凝靜脈血與等量Hanks液或RPMI1640液充分混勻，用滴管沿管壁緩慢疊加于分層液面上，注意保持清楚的界面。水平離心2 000 rpm，20 min。
3.離心后管內分為三層，上層為血漿和Hank's液、下層主要為紅細胞和粒細胞。中層為淋巴細胞分離液，在上、中層界面處有一處以單個核細胞為主的白色云霧層狹窄帶，單個核細胞包括淋巴細胞和單核細胞。此外，還含有血小板。
4.用彎頭滴管插到云霧層，仔細吸取單個核細胞；也可采用先吸棄上層RPMI 1640和血漿，然后收集富含PBMC的云霧層。將云霧層細胞置人另一短中管中，加人5倍以上體積的Hank's液或RPMI 1640，1500 rpm離心10min，洗滌細胞兩次。
5.末次離心后，棄上清，加入含有10%小牛血清的RPMI 1640，重懸細胞。取一滴細胞懸液與一滴0.2%臺盼蘭染液混合，于血球計數板上，計數四個大方格內的細胞總數。單個核細胞濃度（細胞數/1ml細胞懸液）=4個大方格內細胞總數/4×10⁴×2（稀釋倍數）。
6.細胞活力檢測：死的細胞可被染成藍色，活細胞不著色。計數200個淋巴細胞。計算出活細胞百分率�；罴毎�百分率（%）=活細胞數/總細胞數×100%。
7.細胞培養(yǎng)：細胞計數后調整細胞濃度為2×10⁵/ml培養(yǎng)基，加于六孔板或24孔板中進行培養(yǎng)。
8.細胞收集：將六孔板或二十四孔板中的培養(yǎng)基吸出棄掉，每孔加200µL Trizol，用移液槍將孔壁吹打數次后，將Trizol轉入EP管中。
9.細胞凍存：將收集的細胞放入-80℃冰箱中保存。

三．實驗過程中的注意事項

1. Ficoll應適量，外周血應充分稀釋。

2. 溫度直接影響到Ficoll的比重和分離效果。

3. 在Ficoll上加入稀釋后的外周血時，應緩慢加，以免沖散界面。

4. 吸取單個核細胞層時，應避免吸出過多的上清液或分層液而導致血小板污染。

四．羊駝PBMC產品優(yōu)勢

1. 細胞活率高：實驗中使用的分離試劑無菌、低內毒素，對細胞無傷害刺激，操作人員具備多年PBMC細胞分離經驗，最大程度保證細胞的原始狀態(tài)，分離后的新鮮細胞或凍存復蘇后的活率可達90%以上。

2. 產品安全性高、無傳染源：嚴格把控羊駝/駱駝全血來源，保證實驗駱駝均經過相關傳染源檢測，為客戶提供更安全、更放心的實驗材料。

3. 細胞來源清晰、可溯源：分離羊駝/駱駝使用的全血均由正規(guī)動物中心提供采集，具備完全合規(guī)的采購流程以及全血生物安全證書，免除客戶使用的后顧之憂。

泰克生物具有成熟的動物PBMC分離技術，保證細胞分離過程中不受損害、不被刺激，后期的純化技術保證駱駝單個核細胞的純度以及活率等技術指標，適用于后期的細胞培養(yǎng)、抗體制備等其他研究。