從2D到3D共培養(yǎng)系統(tǒng)：研究神經(jīng)細(xì)胞相互作用的共培養(yǎng)模型

中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）是人體內(nèi)結(jié)構(gòu)和功能最復(fù)雜的系統(tǒng)。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的基本組織是神經(jīng)組織，主要由神經(jīng)元（神經(jīng)細(xì)胞）和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成。神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以極其精妙和高度復(fù)雜的方式組合在一起，形成具有三維（3D）結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)。通過神經(jīng)元或其他細(xì)胞之間復(fù)雜有序的連接，形成各種神經(jīng)傳導(dǎo)通路和神經(jīng)回路，控制和調(diào)節(jié)器官系統(tǒng)的功能活動(dòng)，維持機(jī)體與外界環(huán)境的統(tǒng)一。

因此，對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的理解不能局限于單一類型的細(xì)胞或單個(gè)器官，而應(yīng)基于多層次和多角度的多器官認(rèn)識(shí)。細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)的出現(xiàn)使得闡明體外神經(jīng)細(xì)胞之間的相互作用和復(fù)制復(fù)雜的神經(jīng)回路成為可能。共培養(yǎng)系統(tǒng)可用于研究：（1）細(xì)胞分化；（2）細(xì)胞的功能和活性；（3）細(xì)胞增殖和遷移；（4）中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)展；（5）代謝機(jī)制。

基于此，吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系、病原生物學(xué)系課題組的一項(xiàng)研究曾綜述了與神經(jīng)細(xì)胞相互作用相關(guān)的基于二維（2D）和3D共培養(yǎng)系統(tǒng)的體外模型，同時(shí)進(jìn)一步討論了類器官共培養(yǎng)系統(tǒng)應(yīng)用的最新進(jìn)展，特別關(guān)注那些通過神經(jīng)調(diào)節(jié)應(yīng)用分析證明了明確相互作用的系統(tǒng)。
2D共培養(yǎng)模型在神經(jīng)細(xì)胞相互作用研究中的應(yīng)用

細(xì)胞共培養(yǎng)模型可用于觀察細(xì)胞之間或細(xì)胞與其周圍微環(huán)境之間的相互作用，可分為直接接觸共培養(yǎng)模型和間接接觸共培養(yǎng)模型。

直接接觸共培養(yǎng)是指將兩種或兩種以上的細(xì)胞按一定比例混合并在特定條件下接種在同一界面上。該系統(tǒng)最明顯的優(yōu)勢(shì)是它可以證明神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞之間的相互作用。此外，還可以在共培養(yǎng)系統(tǒng)中添加額外的調(diào)節(jié)因子，如免疫細(xì)胞因子，以研究細(xì)胞間相互作用。

飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)是將細(xì)胞接種在單層細(xì)胞（如顆粒細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、輸卵管上皮細(xì)胞等）上的系統(tǒng)。這些飼養(yǎng)層細(xì)胞用有絲分裂阻斷劑（常用絲裂霉素）處理以抑制細(xì)胞分裂，但保留分泌生長因子的能力�；�于兩種細(xì)胞類型的共培養(yǎng)，建立了由神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞組成的三重培養(yǎng)系統(tǒng)，該系統(tǒng)更真實(shí)地模擬了體內(nèi)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而可以更好地了解細(xì)胞串?dāng)_對(duì)神經(jīng)炎癥的影響。

間接接觸共培養(yǎng)是培養(yǎng)兩種或兩種以上不同的細(xì)胞類型，使細(xì)胞通過培養(yǎng)基內(nèi)的化學(xué)因子相互作用，而沒有物理直接接觸。實(shí)現(xiàn)此目的的方法如圖1。例如，通過Transwell方法對(duì)施旺細(xì)胞（SCs）和神經(jīng)元進(jìn)行共培養(yǎng)表明，SCs分泌的β-細(xì)胞素可以影響神經(jīng)元行為并增加突觸長度，從而促進(jìn)神經(jīng)再生。

從2D共培養(yǎng)條件獲得的數(shù)據(jù)可能具有與體內(nèi)不同的結(jié)果，2D培養(yǎng)物中細(xì)胞的生長模式、形態(tài)和功能與體內(nèi)生理?xiàng)l件下的細(xì)胞明顯不同。2D細(xì)胞培養(yǎng)中的異常細(xì)胞形態(tài)會(huì)影響細(xì)胞增殖、分化、凋亡、基因和蛋白表達(dá)以及許多其他細(xì)胞過程。 圖1    實(shí)現(xiàn)間接接觸共培養(yǎng)的方法。（1）條件培養(yǎng)基：收集含有各種生長因子或細(xì)胞分泌刺激物的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以研究因子對(duì)細(xì)胞生長或分化的影響。（2）蓋玻片上的飼養(yǎng)層細(xì)胞：分泌某些因子的細(xì)胞也可以接種在蓋玻片上，以避免與接種在培養(yǎng)皿中的細(xì)胞直接接觸。（3）Transwell培養(yǎng)系統(tǒng)：Transwell室中的細(xì)胞共培養(yǎng)系統(tǒng)。

3D共培養(yǎng)模型在神經(jīng)細(xì)胞相互作用研究中的應(yīng)用

由于3D共培養(yǎng)系統(tǒng)模擬體內(nèi)環(huán)境，因此為研究復(fù)雜的神經(jīng)細(xì)胞相互作用提供了一種可靠的方法，例如各種神經(jīng)細(xì)胞之間的協(xié)同和保護(hù)作用。3D共培養(yǎng)技術(shù)可以展示細(xì)胞活性和細(xì)胞間的分化、蛋白表達(dá)等反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)真實(shí)的細(xì)胞生物學(xué)和功能。在這里，研究將3D共培養(yǎng)系統(tǒng)分為基于細(xì)胞的3D共培養(yǎng)系統(tǒng)，基于組織切片的3D共培養(yǎng)系統(tǒng)和基于類器官的3D共培養(yǎng)系統(tǒng)（圖2）。 圖2    3D共培養(yǎng)模型在神經(jīng)細(xì)胞相互作用研究中的應(yīng)用：（1）不同類型的神經(jīng)細(xì)胞在凝膠化后可以包裹成具有一定3D結(jié)構(gòu)的水凝膠。（2）細(xì)胞可以與器官型切片共培養(yǎng)，保留了體外系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)。（3）可以開發(fā)基于類器官的共培養(yǎng)系統(tǒng)來研究涉及多個(gè)系統(tǒng)或組織的疾病過程。

基于細(xì)胞的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)

為了構(gòu)建模擬體內(nèi)結(jié)構(gòu)的3D結(jié)構(gòu)，可以將神經(jīng)細(xì)胞包裹到水凝膠中，凝膠化后具有一定的3D結(jié)構(gòu)。天然和合成水凝膠都已用于3D系統(tǒng)的生物工程。

基底膠是一種天然水凝膠，對(duì)維持細(xì)胞生長、促進(jìn)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元、促進(jìn)軸突延伸等具有積極作用。除基底膠外，膠原蛋白水凝膠對(duì)神經(jīng)譜系也有類似的作用。Yang等人報(bào)道，小分子和膠原蛋白水凝膠的聯(lián)合治療可以誘導(dǎo)原位內(nèi)源性NSCs向神經(jīng)元分化并恢復(fù)受損功能。另一種天然水凝膠，海藻酸鹽，也被用作構(gòu)建3D細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)的潛在生物材料，因?yàn)樵逅猁}的結(jié)構(gòu)類似于透明質(zhì)酸，透明質(zhì)酸是大腦ECM的主要成分。研究表明，包裹的人多能干細(xì)胞（hPSCs）衍生神經(jīng)元粘附在水凝膠基質(zhì)上并形成3D神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。

最近的研究表明，天然材料，如基底膠和海藻酸鹽，可以設(shè)計(jì)和合成水凝膠復(fù)合材料，并開發(fā)用于制造具有孔隙或排列結(jié)構(gòu)的支架。研究表明，水凝膠復(fù)合材料可以成為具有高導(dǎo)電性和生物相容性以促進(jìn)神經(jīng)再生的有前途的材料。脫細(xì)胞組織基質(zhì)（DTM）是開發(fā)個(gè)性化臨床方法的另一種有前途的支架，并且在促進(jìn)神經(jīng)組織再生方面顯示出其獨(dú)特而有益的特征，特別是那些來自CNS的神經(jīng)組織再生。

總之，水凝膠支架可以輕松支持3D神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)，這些支架是多孔的，有助于氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和代謝物的運(yùn)輸。因此，細(xì)胞可以在支架網(wǎng)絡(luò)內(nèi)增殖和遷移，并最終粘附在支架網(wǎng)絡(luò)，然而，用這種技術(shù)獲得的球體的大小應(yīng)該得到控制，因?yàn)橐粋�(gè)大的3D球體會(huì)由于缺乏營養(yǎng)而引起中心壞死。

基于組織切片的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)

組織切片保留了體外系統(tǒng)的主要優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了細(xì)胞系功能不足，并在一定程度上保持了組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)、組織活性和器官功能，從而提供了有利于神經(jīng)分化和神經(jīng)元回路的有利微環(huán)境。器官型切片的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是在其生理狀態(tài)下保存血管系統(tǒng)的3D排列。

器官型切片和共培養(yǎng)技術(shù)的結(jié)合對(duì)各種神經(jīng)通路和疾病的模型特別有益。例如，在缺氧-葡萄糖條件下，海馬組織切片可用于模擬氧化應(yīng)激引起的CNS損傷。成人全腦冠狀切片和膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（GSCs）的共培養(yǎng)可用于模擬膠質(zhì)母細(xì)胞瘤腫瘤-宿主細(xì)胞相互作用，并研究多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療。除了腦切片，脊髓切片還廣泛用于神經(jīng)學(xué)研究，如神經(jīng)修復(fù)和再生。在一項(xiàng)研究中，將大鼠脊髓切片與周圍神經(jīng)移植物共培養(yǎng)，并給予不同濃度的米諾環(huán)素，以觀察其對(duì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活率的影響。這種共培養(yǎng)系統(tǒng)似乎是一個(gè)有用且有前途的模型，用于進(jìn)一步研究驅(qū)動(dòng)神經(jīng)和內(nèi)皮組織之間復(fù)雜相互作用的機(jī)制。

雖然基于切片的共培養(yǎng)系統(tǒng)提供了高度貼近人體的微環(huán)境，但仍存在一定的局限性，如組織切片的制作和操作過程復(fù)雜，需要相對(duì)精細(xì)的操作和經(jīng)驗(yàn)積累。此外，與其他體外培養(yǎng)物一樣，腦切片不能完全再現(xiàn)體內(nèi)的生理環(huán)境。

基于類器官的 3D 共培養(yǎng)系統(tǒng)

一種新的來源于PSCs的3D模型，被稱為類器官，在神經(jīng)發(fā)育建模、疾病機(jī)制分析和開發(fā)潛在療法方面具有很大的前景。類器官，如腦類器官和脊髓類器官，可以在體外復(fù)制神經(jīng)發(fā)育，探索不同CNS區(qū)域之間的相互作用，探索人類CNS的進(jìn)化及其獨(dú)特的調(diào)控機(jī)制。因此，可以開發(fā)基于類器官的共培養(yǎng)系統(tǒng)來研究涉及多個(gè)系統(tǒng)或組織的疾病過程，例如神經(jīng)肌肉疾患（NMDs），肌萎縮側(cè)索硬化癥（ALS）以及不同CNS和局部回路之間的復(fù)雜連接。

2017年，Birney等人生成了一個(gè)人體3D微生理系統(tǒng)，其中包括功能整合的谷氨酸能和γ-氨基丁酸能（GABA）神經(jīng)元，類似于背側(cè)或腹側(cè)前腦，以捕獲更復(fù)雜的發(fā)育過程。此外，融合區(qū)域特異性類器官，然后進(jìn)行實(shí)時(shí)成像，能夠分析人類中間神經(jīng)元遷移和整合，以模擬人類中間神經(jīng)元遷移。最典型的基于類器官的共培養(yǎng)系統(tǒng)是腦-脊髓-骨骼肌組合，可用于模擬NMD。2019年，Lancaster的研究小組發(fā)表了在氣液界面培養(yǎng)腦類器官的方案，并成功利用腦類器官控制肌肉收縮。該系統(tǒng)不僅大大提高了神經(jīng)元的成熟和存活率，而且侵入了腦類器官神經(jīng)元的軸突來控制脊髓。通過控制脊髓，然后控制肌肉，不同CNS和局部回路之間的復(fù)雜連接在體外得以完美再現(xiàn)。

利用共培養(yǎng)系統(tǒng)建立微生物感染神經(jīng)疾病模型

某些微生物（如病毒）可以穿過血腦屏障并進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。因此，類器官可以與微生物共培養(yǎng)，以建立微生物感染的神經(jīng)疾病模型。

寨卡病毒（ZIKV）是一種蚊媒病毒，成人感染通常較輕，而孕婦感染寨卡病毒可能導(dǎo)致新生兒小頭畸形。使用ZIKV感染的前腦類器官，Haddow等人觀察到與對(duì)照組相比，受感染的前腦類器官的大小顯著減小。這項(xiàng)研究表明，在進(jìn)入胎兒大腦后，ZIKV感染神經(jīng)前體細(xì)胞（NPCs）并引起細(xì)胞凋亡，在皮質(zhì)發(fā)育中引起小的頭狀缺陷。除了揭示其機(jī)制外，ZIKV感染的腦類器官也可用于篩選治療ZIKV感染的藥物。

由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS-CoV-2）引起的2019年冠狀病毒�。–OVID-19）會(huì)引起可能致命的呼吸道癥狀。然而，在腎臟、心臟、肝臟和大腦等其他器官也發(fā)現(xiàn)了損傷和功能障礙。越來越多的臨床證據(jù)顯示神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，尸檢結(jié)果也表明，一些患者的大腦中存在病毒。由于這些特征，腦類器官被廣泛用于研究病毒感染CNS的位置及其潛在靶標(biāo)。研究表明，SARS-CoV-2病毒感染腦脈絡(luò)叢，可破壞腦類器官中的血腦屏障。另一項(xiàng)研究使用人iPSC衍生的單層腦細(xì)胞和區(qū)域特異性腦類器官來確定感染與炎癥反應(yīng)和細(xì)胞功能缺陷有關(guān)。研究結(jié)果支持腦類器官為發(fā)現(xiàn)COVID-19神經(jīng)精神并發(fā)癥的病理生理學(xué)線索和潛在治療選擇提供了一種有希望的工具。

總而言之，共培養(yǎng)系統(tǒng)，尤其是基于類器官的共培養(yǎng)系統(tǒng)，是控制和分析細(xì)胞相互作用的強(qiáng)大工具和技術(shù)。然而，類器官模型是人體組織實(shí)驗(yàn)研究中的最新技術(shù)。與傳統(tǒng)模式相比，仍處于探索階段。其穩(wěn)定性、可重復(fù)性、可擴(kuò)展性以及如何精確控制微環(huán)境條件已成為類器官共培養(yǎng)技術(shù)發(fā)展中需要克服的問題。這些努力大多仍然是原則證明，而不是現(xiàn)有模式的充分發(fā)展和廣泛適用的替代辦法，具有固有的優(yōu)勢(shì)和局限性。為了創(chuàng)建用于細(xì)胞相互作用研究的相關(guān)共培養(yǎng)系統(tǒng)，需要將類器官模型與標(biāo)準(zhǔn)化微設(shè)備相結(jié)合。


參考文獻(xiàn)：Liu R, Meng X, Yu X, Wang G, Dong Z, Zhou Z, Qi M, Yu X, Ji T, Wang F. From 2D to 3D Co-Culture Systems: A Review of Co-Culture Models to Study the Neural Cells Interaction. Int J Mol Sci. 2022 Oct 28;23(21):13116. doi: 10.3390/ijms232113116. PMID: 36361902; PMCID: PMC9656609.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/36361902/

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