表面重塑抗體技術(shù)介紹

一．表面重塑抗體簡介

表面重塑抗體是指對異源抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換；另外，所替換的區(qū)段不應(yīng)過多，對于影響側(cè)鏈大小、電荷、疏水性，或可能形成氫鍵從而影響到抗體互補決定區(qū)（CDR）構(gòu)象的殘基盡量不替換。

二．表面重塑抗體方法

通過將抗體可變區(qū)序列同鼠源，人源抗體可變區(qū)序列庫比對后，獲得其差異和異常殘基。進一步通過三維模建、分析抗體可變區(qū)分子內(nèi)與分子間氫鍵作用位點和表面可及性基礎(chǔ)上，去除參與氫鍵形成與疏水性核心殘基，在確�？贵w結(jié)構(gòu)完整與親和力的原則上完成抗體可變區(qū)的人源化改造。

三．表面重塑抗體制備流程（技術(shù)難點）

抗體可變區(qū)序列分析及其人源化設(shè)計

利用ORFfinder將抗體V_H和V_L的核酸序列進行翻譯，利用IMGT和VBase2的DNA PLOT對其核酸序列進行分析，確定所屬的VDJ基因家族；根據(jù)Kabat、Abm、Chothia和Contact的規(guī)則標出CDR區(qū)。之后同Genbank的nr庫做BlastP，從中抽取抗體可變區(qū)氨基酸序列信息和結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)構(gòu)建本地抗體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫，根據(jù)抗體種屬來源和輕、重鏈類型將抗體序列分為四類，其中組織來源分別選擇Homo sapiens和Mus musculus兩類。

對相似性得分最高的人源、鼠源抗體可變區(qū)序列各200條進行統(tǒng)計，確定每個位置上的氨基酸種類百分比；將在鼠源比對序列中存在95%以上不同氨基酸的殘基定義為異常殘基（preternatural residue），對應(yīng)地，在人源比對序列中存在95%以上不同氨基酸的同樣定義為差異殘基（differential residue）；然后對抗體的三維結(jié)構(gòu)模建和結(jié)構(gòu)分析即用SWISS-MODEL對可變區(qū)同源模建，使用Swiss-Pdb Viewer3.7的Energy Minimisation在Gromos96力場下對結(jié)果優(yōu)化。從PDB中挑選與抗體V_L、V_H組成的Fv相似性得分合計值最高的5個抗體結(jié)構(gòu)。利用Swiss-Pdb Viewer 3.7的Interactive fit 功能將抗體V_H、V_L以該抗體結(jié)構(gòu)為模板進行空間拼接，所有結(jié)果使用Gromos96力場的Force Field 計算能量值，將最小能量值的對接模型使用Discover在Cvff力場下進行分子力學優(yōu)化，得到精確的三維模型。使用Naccess以范德華半徑為參數(shù)計算抗體V_H、V_L及其相對表面可及性。利用Chimera 中的FindHBond分析V_H、V_L分子內(nèi)和分子間氫鍵相互作用。最終確定了候選突變位點，最后對人源化抗體的模建與分析，并對此結(jié)構(gòu)進行分析。因此所得的人源性VH與VL基因可編碼正確的抗體可變區(qū)。

抗體人源化是重組抗體生產(chǎn)制備實驗研究的重要組成部分，獲得高特異性和親和性的人源化抗體，對很多疾病進行有效的抗體治療具有重要作用。