精調(diào) Piezo1 表達(dá)和活性可確保骨骼肌肌發(fā)生過(guò)程中高效的成肌細(xì)胞融合

骨骼肌是人體中最大的肌肉組織，由有絲分裂后的多核肌纖維構(gòu)成。肌肉干細(xì)胞，也被稱為衛(wèi)星細(xì)胞（SCs），是骨骼肌中位于肌纖維和基膜之間，當(dāng)受到外界刺激導(dǎo)致肌細(xì)胞損傷時(shí)，它們被激活形成成肌細(xì)胞，并具有增殖和分化能力，能夠修復(fù)受損的肌纖維，并與原有的肌細(xì)胞進(jìn)行融合重建肌肉纖維，骨骼肌得到再生。因此，成肌細(xì)胞融合機(jī)制的改變會(huì)對(duì)再生效率和整體肌肉功能和健康產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響。決定成肌細(xì)胞融合的一個(gè)重要過(guò)程是機(jī)械感受，但這如何在肌肉中調(diào)節(jié)仍然在很大程度上是未知的。

機(jī)械敏感性（MS）離子通道是指一類感受細(xì)胞膜表面應(yīng)力變化，實(shí)現(xiàn)胞外機(jī)械信號(hào)向胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的通道。Piezo1和Piezo2首先被確定為哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的力傳感器。Piezo1是機(jī)械敏感性的非選擇性陽(yáng)離子通道，對(duì)Na+、K+、Ca2+ 和 Mg2+ 全部滲透，但更偏向Ca2+。Ca2+ 調(diào)節(jié)在骨骼肌的保持和修復(fù)中起著至關(guān)重要的作用，因此，在開(kāi)發(fā)肌營(yíng)養(yǎng)不良癥（肌肉萎縮癥）的治療干預(yù)措施時(shí)，了解Piezo1的功能可能至關(guān)重要。

在日本豐橋創(chuàng)造大學(xué)健康科學(xué)學(xué)院、英國(guó)倫敦國(guó)王學(xué)院蘭德?tīng)柤?xì)胞和分子生物物理中心等團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究中，分析了Piezo1在骨骼肌肌發(fā)生中的作用，重點(diǎn)關(guān)注肌肉分化及其在拉伸誘導(dǎo)的原代成肌細(xì)胞來(lái)源的肌管 Ca2+ 內(nèi)流中的作用。研究成果發(fā)表在 Cells 期刊題為“Fine-Tuning of Piezo1 Expression and Activity Ensures Efficient Myoblast Fusion during Skeletal Myogenesis”。
 

首先，為了研究Piezo1在肌源性進(jìn)展過(guò)程中的表達(dá)水平，利用小鼠快趾長(zhǎng)伸�。‥DL）和慢比目魚(yú)肌（SOL）肌肉衛(wèi)星細(xì)胞（SC）來(lái)源的原代成肌細(xì)胞（圖1 a）。在SOL來(lái)源的成肌細(xì)胞中，Piezo1表達(dá)在24小時(shí)后迅速增加，表明Piezo1在慢肌肉發(fā)生中的早期功能。與EDL來(lái)源的成肌細(xì)胞相比，Piezo1在SOL來(lái)源的成肌細(xì)胞中在24小時(shí)和72小時(shí)的分化上調(diào)（圖1 b）。因此，Piezo1表達(dá)在成肌細(xì)胞分化期間增加。然而，在蛋白質(zhì)水平上發(fā)現(xiàn)EDL和SOL來(lái)源的肌管在同一水平上調(diào)Piezo1（圖1 c-e）。這可能是由于這些肌肉群之間的轉(zhuǎn)錄和翻譯差異。這些結(jié)果要求進(jìn)一步研究Piezo1在EDL和SOL來(lái)源細(xì)胞中的積極作用。

Ca2+ 本身是肌肉收縮的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是肌肉形成和分化/融合過(guò)程中早期的重要調(diào)控。因此，鑒于Piezo1 mRNA在分化成肌細(xì)胞中的積累，實(shí)驗(yàn)試圖評(píng)估Ca2+ 內(nèi)流（[Ca2+]i）的動(dòng)力學(xué)在培養(yǎng)的肌管中對(duì)Piezo1活性的調(diào)節(jié)，將樣本分為兩組：給予Piezo1特異性siRNA（Piezo1-敲低）和給予Piezo1激動(dòng)劑Yoda1（30μM），給藥前施加漸進(jìn)拉伸，在最初的1分鐘休息時(shí)間（0%拉伸）后，拉伸量分別為3% 、6% 和9%，持續(xù)1分鐘，然后休息1分鐘。

在對(duì)照條件下（siRNA對(duì)照和無(wú)Yoda1），在機(jī)械拉伸時(shí)，[Ca2+]i 在EDL來(lái)源和SOL來(lái)源的肌管中與無(wú)拉伸（0%）對(duì)照組相比顯著增加。EDL來(lái)源的對(duì)照肌管，拉伸力超過(guò)3% 時(shí)顯示 [Ca2+]i 的顯著增加。與對(duì)照細(xì)胞（siRNA對(duì)照）相比，在 [Ca2+]i 響應(yīng)拉伸后Piezo1的減少被強(qiáng)烈抑制。[Ca2+]i 在EDL來(lái)源的肌管中被完全消除，6% 和9% 的拉伸都不會(huì)引起其顯著增加。同樣，在所有拉伸組中，SOL來(lái)源的肌管中Piezo1的減少顯示出 [Ca2+]i 的顯著降低，只有Piezo1敲低的肌管在 9% 的拉伸條件下顯示出 [Ca2+]i 的增加。因此，Piezo1對(duì)拉伸期間 Ca2+ 內(nèi)流至關(guān)重要。

Yoda1介導(dǎo)的Piezo1激活能夠降低其激活閾值。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在拉伸（0%拉伸）之前，Yoda1施用的肌管已經(jīng)開(kāi)始顯示出增強(qiáng)的 [Ca2+]i，3% 拉伸時(shí)，[Ca2+]i 顯著升高，這種 [Ca2+]i 的增加在高拉伸時(shí)持續(xù)存在。總之，Piezo1的表達(dá)和活性對(duì)肌肉功能中的Ca2+調(diào)節(jié)至關(guān)重要。
 

圖1 Piezo1表達(dá)在分化的SC來(lái)源的成肌細(xì)胞中增加。

Piezo1 表達(dá)在后期肌生成階段中達(dá)到峰值，它調(diào)節(jié)收縮期間的鈣內(nèi)流。然而，Piezo1 是否參與肌生成的早期階段尚不清楚。因此，評(píng)估了Piezo1 對(duì)增殖和肌生成開(kāi)始的影響，發(fā)現(xiàn)Piezo1的敲低對(duì)EDL和SOL來(lái)源的成肌細(xì)胞的增殖速率沒(méi)有明顯影響，因此Piezo1對(duì)于肌肉細(xì)胞增殖是可有可無(wú)的。接下來(lái)，通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄因子Myogenin （肌細(xì)胞生成素）的積累，研究了 Piezo1 的減少是否可以改變分化階段的入口。EDL來(lái)源或SOL來(lái)源的成肌細(xì)胞均未在Piezo1敲低和對(duì)照siRNA處理?xiàng)l件下顯示Myogenin -陽(yáng)性細(xì)胞相對(duì)比例上的顯著差異，表明Piezo1不參與成肌細(xì)胞分化的發(fā)生。

成肌細(xì)胞融合需要廣泛的膜重塑和機(jī)械應(yīng)力，因此，評(píng)估了Piezo1抑制對(duì)肌管形成和成熟的影響。Piezo1的敲低導(dǎo)致成肌細(xì)胞融合的顯著減少，隨后阻礙了EDL和SOL來(lái)源的肌管的形成。EDL 和 SOL 來(lái)源的成肌細(xì)胞顯示融合蛋白Myomaker的表達(dá)降低，表明融合機(jī)制在分子水平上發(fā)生了改變。另一方面，Myomixer 蛋白的表達(dá)呈下降趨勢(shì)。此外，早期形成的肌管中Piezo1的敲低證實(shí)了融合指數(shù)的顯著降低�？傊�，Piezo1表達(dá)的失調(diào)降低了細(xì)胞融合到新的或現(xiàn)有的肌管中的能力。

Piezo1的敲低可減少成肌細(xì)胞融合并改變 Ca2+ 內(nèi)流。接下來(lái)，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了Piezo1激活的劑量依賴性效應(yīng)，對(duì)早期形成的肌管在一段時(shí)間內(nèi)經(jīng)受不同濃度的Yoda1（圖2）。Yoda1 的1分鐘處理顯著增強(qiáng)了細(xì)胞融合（圖2 a-d），然而，用最高劑量（100 μM）的Yoda1進(jìn)行30分鐘的處理具有相反的效果，降低了融合指數(shù)，這表明必須精細(xì)調(diào)控Piezo1活性以實(shí)現(xiàn)有效的融合和肌管成熟。在孵育30分鐘時(shí)，EDL和SOL來(lái)源的肌管在30 μM Yoda1 下均顯示融合增加（圖2 b、d）。孵育 1 小時(shí)后，EDL和SOL來(lái)源的肌管在5、10 和30 μM Yoda1 處理下表現(xiàn)出更高的融合效率（圖2 b、d）。

在分子水平上，Yoda1給藥后EDL和SOL來(lái)源的肌管中的Piezo1表達(dá)增加。Myomaker表達(dá)在EDL和SOL來(lái)源的肌管中也與Piezo1上調(diào)平行，而Myomixer呈現(xiàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)意義的增加�？傊�，數(shù)據(jù)表明，Piezo1活性的精細(xì)調(diào)控是分化動(dòng)力學(xué)的關(guān)鍵步驟。

實(shí)驗(yàn)注意到，誘導(dǎo)激活Piezo1似乎會(huì)影響肌管的大小，盡管增加了成肌細(xì)胞融合。為了解決這個(gè)問(wèn)題，將這些樣本的肌管寬度（直徑）與DMSO對(duì)照比較。有趣的是，EDL和SOL來(lái)源的肌管與Yoda1處理時(shí)均顯示肌管寬度減小。綜上所述，Piezo1的過(guò)度激活使成肌細(xì)胞融合和肌管生長(zhǎng)不平衡。
 

圖2 Piezo1 活化以肌管合胞體成熟為代價(jià)增加成肌細(xì)胞融合。

隨著成肌細(xì)胞融合，成肌分化需要廣泛的細(xì)胞重塑，先前的研究將Piezo1調(diào)節(jié)在細(xì)胞骨架穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。最后，為了了解 Piezo1 是否有助于調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，包括 F-肌動(dòng)蛋白，實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 EDL 和 SOL 來(lái)源的肌管中成肌分化期間細(xì)胞骨架重組的程度。Piezo1敲低顯示F-肌動(dòng)蛋白的積累顯著減少，表明Piezo1的降低會(huì)改變細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)。相比之下，F(xiàn)-肌動(dòng)蛋白積累不受Piezo1過(guò)度激活的影響，這表明Piezo1可能不直接促進(jìn)F-肌動(dòng)蛋白重塑。與成肌細(xì)胞融合的改變一致，過(guò)度Piezo1的化學(xué)激活顯示EDL和SOL來(lái)源的肌管中的F-肌動(dòng)蛋白顯著降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，Piezo1表達(dá)和/或其激活狀態(tài)的失調(diào)會(huì)影響成肌細(xì)胞融合和肌肉分化過(guò)程中的細(xì)胞骨架組織。

總之，該研究中提供的數(shù)據(jù)表明，Piezo1通道存在于SC來(lái)源的成肌細(xì)胞和肌管中，但在后者中表達(dá)的比例更高。Piezo1的下調(diào)顯著降低了肌管形成、生長(zhǎng)和成熟過(guò)程中的融合能力。相比之下，Piezo1活化增加了融合。未來(lái)研究肌管功能（完整性、Ca2+內(nèi)流、細(xì)胞骨架組織和融合）的變化是機(jī)械應(yīng)力的直接結(jié)果，應(yīng)該考慮對(duì)Piezo1的分析。在針對(duì)DMD等肌肉萎縮癥的治療策略的背景下，我們不僅必須解開(kāi)Piezo1表達(dá)的時(shí)空調(diào)控，而且必須意識(shí)到該通道改變其Ca2+ 內(nèi)流閾值的能力。從藥學(xué)上講，像 Yoda1 這樣的小激活分子可能是有益的。然而，在考慮這些激動(dòng)劑作為可行藥物之前，必須注意這些激動(dòng)劑在體內(nèi)的半衰期和藥代動(dòng)力學(xué)。Piezo1在骨骼肌維護(hù)和功能方面的重要性無(wú)疑將隨著新的研究而增長(zhǎng)。此外，鑒于Piezo1在肌源性進(jìn)展中的關(guān)鍵作用及其在衛(wèi)星細(xì)胞中的表達(dá)，Piezo1活性的改變可能與衛(wèi)星細(xì)胞病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

參考文獻(xiàn)：Ortuste Quiroga HP, Ganassi M, Yokoyama S, Nakamura K, Yamashita T, Raimbach D, Hagiwara A, Harrington O, Breach-Teji J, Asakura A, Suzuki Y, Tominaga M, Zammit PS, Goto K. Fine-Tuning of Piezo1 Expression and Activity Ensures Efficient Myoblast Fusion during Skeletal Myogenesis. Cells. 2022 Jan 24;11(3):393. doi: 10.3390/cells11030393. PMID: 35159201; PMCID: PMC8834081.

原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35159201/

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