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細(xì)胞鋪板實(shí)驗(yàn)主要步驟及注意事項(xiàng)

瀏覽次數(shù):1461 發(fā)布日期:2023-11-1  來(lái)源:本站 僅供參考,謝絕轉(zhuǎn)載,否則責(zé)任自負(fù)

細(xì)胞鋪板是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中必須掌握的一門技術(shù),雖然看起來(lái)非常簡(jiǎn)單,但卻難以掌握。

很多人經(jīng)常會(huì)遇到細(xì)胞中間密或者中間稀疏等「細(xì)胞分布不均勻」的情況。如下圖為:細(xì)胞鋪板時(shí),常出現(xiàn)的細(xì)胞分布不均勻現(xiàn)象。
 

細(xì)胞鋪板時(shí)常出現(xiàn)的細(xì)胞分布不均勻現(xiàn)象


鋪板成功的關(guān)鍵在于對(duì)細(xì)胞消化和鋪板方法的正確拿捏和掌握。

(1)細(xì)胞一定要消化好;

(2)鋪板前要混勻,把存在的細(xì)胞團(tuán)盡可能分開(kāi)。
 

細(xì)胞鋪板實(shí)驗(yàn)


主要分為3大步驟:收集細(xì)胞→細(xì)胞計(jì)數(shù)→細(xì)胞鋪板。

一、收集細(xì)胞,制作單細(xì)胞懸液
① 吸棄培養(yǎng)皿中的原培養(yǎng)液,用1~2 ml 的PBS洗兩次
② 棄去PBS,加入適量胰酶進(jìn)行消化,顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮、變圓,結(jié)束消化。(不同細(xì)胞消化時(shí)間差異較大)
③ 消化完全后,吸取細(xì)胞懸液離心(800 rpm*5 min),棄去上清液,加入適量培養(yǎng)基制得單細(xì)胞懸液(可能需要稀釋,防止細(xì)胞數(shù)太多影響計(jì)數(shù)結(jié)果),進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
Tips:
★消化細(xì)胞需要選擇適用的消化液、適當(dāng)?shù)南瘻囟群蜁r(shí)間。建議新手或者養(yǎng)的是一個(gè)新細(xì)胞時(shí),預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察最佳胰酶消化時(shí)間及濃度。
★消化后需要輕輕拍打細(xì)胞貼壁面,震落細(xì)胞。
★一般用1000rpm/min離心即可,離心力太大細(xì)胞容易抱團(tuán)!
★離心后,要充分懸浮。一般先加2mL液體后用1mL移液器輕輕將細(xì)胞吹起(注意不要有氣泡),這樣易于形成單細(xì)胞。此外,吹散次數(shù)過(guò)多也會(huì)影響細(xì)胞活力,所以要熟練操作,盡快上板。

二、細(xì)胞計(jì)數(shù)
在顯微鏡下觀察細(xì)胞計(jì)數(shù)板,分別記錄 1、2、3、4 每個(gè)方格的細(xì)胞數(shù)目,計(jì)上不計(jì)下,計(jì)左不計(jì)右。四個(gè)方格的細(xì)胞總數(shù)記為 X。因?yàn)槊總(gè)方格的容積為0.1mm3,即0.1×10-3ml,可知細(xì)胞懸液密度C1=(X/4)/(0.1×10-3ml)=(X/4)×104個(gè)/ml。如果計(jì)數(shù)前進(jìn)行了稀釋且稀釋倍數(shù)為M,則原細(xì)胞懸液密度為C2=(X/4)×M×104個(gè)/ml。確定細(xì)胞懸液密度后,再根據(jù)每個(gè)孔需添加的細(xì)胞數(shù)及孔數(shù)確定所需加液量。

三、細(xì)胞接種
需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇不同規(guī)格的培養(yǎng)板。如在進(jìn)行藥物對(duì)待測(cè)細(xì)胞半抑制率(IC50)測(cè)試時(shí),通常使用96孔板,一方面可以設(shè)置濃度梯度;另外還可一次性測(cè)多個(gè)藥物,減少實(shí)驗(yàn)誤差。


NEST細(xì)胞培養(yǎng)板(6孔、12孔、24孔、96孔、384孔)
 

①稀釋細(xì)胞:根據(jù)細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果后,將細(xì)胞稀釋到目的濃度。

Tips:
細(xì)胞密度對(duì)于鋪板很重要,過(guò)密很容易造成細(xì)胞居中,細(xì)胞濃度過(guò)稀會(huì)造成細(xì)胞難以生長(zhǎng)起來(lái)。一般會(huì)在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。
②加入細(xì)胞懸液
為防止表面張力導(dǎo)致的中間液面太低細(xì)胞聚集的現(xiàn)象,通常在每一個(gè)孔加少量的無(wú)血清培養(yǎng)基,不用太多,浸潤(rùn)孔底即可。一般可加一個(gè)孔,浸潤(rùn),再用移液槍移取,再加入第二個(gè)孔,浸潤(rùn),依此類推。
如果培養(yǎng)液量少,由于瓶體內(nèi)液體有向邊緣吸的特性,所以造成中間低洼,細(xì)胞容易聚集,可以多加點(diǎn)液體緩解。
然后加入細(xì)胞懸液,從孔的左邊靠近底部貼壁慢慢加入,這樣加液后,細(xì)胞懸液會(huì)平鋪在整個(gè)孔底,細(xì)胞分散較均勻,可以避免加在中間位置和加在周邊晃勻后周邊細(xì)胞局部太多的現(xiàn)象。

十字搖勻法:
將板放在水平板面上“十字”形搖勻(上下左右四個(gè)方向進(jìn)行移動(dòng),呈十字形狀,重復(fù)5-6次)。不可以轉(zhuǎn)圈搖,會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞被帶到中間。

一般來(lái)說(shuō),“十字搖勻”對(duì)于12孔板,24孔板,96孔板中接種細(xì)胞時(shí)不怎么適用了。這個(gè)時(shí)候,我們可以通過(guò)輕拍使得細(xì)胞均勻分布。

輕拍搖勻法:
以12孔板為例,在接種細(xì)胞后,合上蓋子,左手大拇指捏住12孔板中間(或者左下角),保持水平,底和蓋子始終緊緊合上。右手掌輕輕拍打右側(cè),注意力度,力道太大培養(yǎng)基會(huì)濺到蓋子上,力度過(guò)小則難以使細(xì)胞混勻,以拍打時(shí)培養(yǎng)基來(lái)回晃動(dòng)且不濺出為宜,拍打右側(cè)10次左右。然后拍打前側(cè),10次左右。這個(gè)時(shí)候細(xì)胞基本鋪勻了,我們可以在顯微鏡下觀察,細(xì)胞懸液是否均勻分布。如果覺(jué)得通過(guò)細(xì)胞懸液不容易判斷細(xì)胞是否均勻,可將12孔板放置于顯微鏡載物臺(tái),10分鐘以后細(xì)胞基本沉降,這時(shí)再進(jìn)行觀察。如果發(fā)現(xiàn)不勻,就重復(fù)前面操作。
注意,12孔板有6個(gè)面,前,后,左,右,上,下。我們只需要拍打兩個(gè)面,右側(cè)和后側(cè)。千萬(wàn)不要每個(gè)面都拍打!另外,拍打次數(shù)也可以根據(jù)實(shí)際情況相應(yīng)調(diào)整,結(jié)合鏡下觀察情況,選擇最適宜自己的方式。

搖勻后要放工作臺(tái)靜置一下,等細(xì)胞貼壁了,輕輕移入到培養(yǎng)箱中。

Tips:
★用排槍吸取時(shí),一定要保證每個(gè)槍頭吸上來(lái)的懸液體積一致。
★如果是用于進(jìn)行MTS等長(zhǎng)時(shí)間測(cè)試時(shí),最外圈應(yīng)空余出來(lái)(中間60孔為最佳,四周的一圈邊緣孔不接細(xì)胞),加入PBS或細(xì)胞懸液(做空白或陰性對(duì)照),以防止培養(yǎng)基蒸發(fā)引起的邊緣效應(yīng)。
培養(yǎng)箱里面或者外面盡量不要放可以產(chǎn)生振動(dòng)的儀器,比如蠕動(dòng)泵、離心機(jī)、渦旋器一類的儀器。這些儀器產(chǎn)生的振動(dòng)對(duì)細(xì)胞貼壁有影響,也可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞貼壁不均勻。

其實(shí)細(xì)胞鋪板不一定都需要單個(gè)單個(gè)的那么均勻。
★免疫熒光時(shí),就可以選擇鋪中間少,周圍稍多的板子。
★在提取蛋白或者提取RNA的時(shí)候有時(shí)會(huì)選擇鋪中間多,四周少的板子,因?yàn)橛行┘?xì)胞刮刀不好用,沒(méi)有辦法刮到周圍的。
來(lái)源:無(wú)錫耐思生命科技股份有限公司
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