小分子化合物在新藥篩選和新適應(yīng)癥發(fā)現(xiàn)等研究中的應(yīng)用

藥物開(kāi)發(fā)周期漫長(zhǎng)，成本高昂，大體分為前期藥物開(kāi)發(fā)、臨床前研究、臨床研究、批準(zhǔn)上市等幾個(gè)環(huán)節(jié)。前期藥物開(kāi)發(fā)是新藥開(kāi)發(fā)中的關(guān)鍵步驟，包括對(duì)疾病機(jī)制的研究、靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)及確認(rèn)、苗頭 (先導(dǎo)) 化合物的發(fā)現(xiàn)等[1]。
高通量篩選技術(shù) (High-Throughput Screening, HTS) 是藥物設(shè)計(jì)中常用技術(shù)之一，用于從化合物庫(kù)中發(fā)現(xiàn)可能成為藥物化學(xué)優(yōu)化的先導(dǎo)化合物，大大加快了大批量化合物篩選的進(jìn)程。
HTS 利用自動(dòng)化快速測(cè)試數(shù)千至數(shù)百萬(wàn)個(gè)樣品，可在模型生物、細(xì)胞、或分子水平上驗(yàn)證生物活性，篩選已知結(jié)構(gòu)的小分子化合物、化學(xué)混合物、天然產(chǎn)物、寡核苷酸和抗體等等[2][3]。
 

小白：小M，我對(duì) HTS 很感興趣，但是我看 MCE 有很多化合物庫(kù)，我該怎樣選擇呀？ 

小 M：如有明確的靶點(diǎn)，通路，疾病的話，推薦選擇相應(yīng)的實(shí)體化合物庫(kù)；若有明確通路相關(guān)的具體蛋白名稱和結(jié)構(gòu)的話，可考慮使用虛擬篩選 (Virtual Screening) 進(jìn)行初步篩選，再根據(jù)虛擬篩選的所得結(jié)果，購(gòu)買對(duì)應(yīng)的實(shí)體化合物。

小白：聽(tīng)起來(lái)有點(diǎn)復(fù)雜？ 

小 M：No no no，其實(shí)并不復(fù)雜，實(shí)驗(yàn)?zāi)康拿鞔_，可迅速找到合適的化合物庫(kù)，我們也可以幫您進(jìn)行篩選匹配出您需要的化合物，根據(jù)您的實(shí)驗(yàn)，所需量，所需濃度定制您的專屬化合庫(kù)~

 

 

小 M: 基于化合物庫(kù)的篩選，主要包括實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，藥物篩選，數(shù)據(jù)分析，先導(dǎo)化合物確認(rèn)等過(guò)程。

▐  Step1 | 關(guān)于篩選方法

如圖 3 所示，HTS 實(shí)驗(yàn)篩選有很多方法，包括細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、生化實(shí)驗(yàn)、以及體內(nèi)簡(jiǎn)單生物體（斑馬魚等）的實(shí)驗(yàn)等。

較為常用的是基于細(xì)胞的篩選，此方法可以提供無(wú)法從生化測(cè)定中獲得的數(shù)據(jù)，例如化合物在特定受體或細(xì)胞內(nèi)靶點(diǎn)上是否存在藥理活性。因此，基于細(xì)胞的篩選特別有希望成為研究細(xì)胞生長(zhǎng)和分化、檢查小分子和細(xì)胞生長(zhǎng)條件對(duì)細(xì)胞功能和生理學(xué)的影響以及了解哺乳動(dòng)物細(xì)胞信號(hào)通路的重要工具[3]。 

 

▐  Step 2 | 基于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的篩選流程

• 初篩

其中細(xì)胞活力/增殖是常用的方法之一，初篩建議先采用單一濃度進(jìn)行篩選。
常用的是 10 μM 進(jìn)行篩選 (如果細(xì)胞可以耐受較高的 DMSO 含量，初篩使用濃度也可以增加到 30 μM/50 μM; 注意做好 DMSO 溶劑對(duì)照!) ，對(duì)比抑制率/激活率或者根據(jù)化合物篩選的活性數(shù)據(jù)及數(shù)量篩選出陽(yáng)性化合物。

注意：初篩使用的化合物濃度越低，篩選出的化合物越少，相對(duì)活性越高。

• 復(fù)篩

將初篩獲得的陽(yáng)性化合物設(shè)置不同濃度梯度進(jìn)行復(fù)篩。建議設(shè)置 6-7 個(gè)濃度，稀釋范圍盡量高于四個(gè)數(shù)量級(jí)，最高濃度設(shè)置可以參考 DMSO 耐受測(cè)試數(shù)據(jù)，一般不超過(guò) 100 μM，每種濃度至少設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。

通過(guò)復(fù)篩結(jié)果，排除假陽(yáng)性化合物及無(wú)濃度依賴關(guān)系化合物，選擇出最佳活性化合物。

• 先導(dǎo)/苗頭化合物驗(yàn)證

由于每種檢測(cè)方法都存在一定的限制，所以對(duì)于初篩或復(fù)篩得到的苗頭化合物，還需要通過(guò)采用與初篩和復(fù)篩不同的檢測(cè)方法做進(jìn)一步驗(yàn)證分析，以排除假陽(yáng)性。

注意：實(shí)驗(yàn)要設(shè)置陰性對(duì)照，陽(yáng)性對(duì)照（如有）及空白對(duì)照等。

接下來(lái)，小 M 給大家舉 2 個(gè)客戶驗(yàn)證的高分栗子！

文獻(xiàn)來(lái)源：Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1154-1168.

IF=37.8

在本篇文章中，客戶利用小分子激酶抑制劑庫(kù) (HY-L009) 和用于 CaMKII-δ9 (人類心臟中最豐富的 CaMKIl-δ 剪接變體) 激酶活性測(cè)定的高通量系統(tǒng)來(lái)篩選出并驗(yàn)證了具有高活性和選擇性的 CaMKIl-δ 小分子抑制劑 -- Hesperadin，是作為具有心臟保護(hù)和抗腫瘤活性雙重功能的先導(dǎo)化合物。

 

圖 5. CaMKIl-δ 抑制劑的篩選流程^[5]。

A: 高通量篩選流程; B: 4160 種化合物對(duì) CaMKII-δ9 激酶活性的抑制率; C: 復(fù)篩中抑制 CaMKII-δ9 激酶活性的 IC₅₀ 最低的前 10 個(gè)化合物的列表。

 

初篩：首先利用 CaMKII-δ9 重組蛋白建立了一個(gè)篩選系統(tǒng)，測(cè)試了包含 4160 個(gè)化合物的抑制劑庫(kù) (部分購(gòu)自 MCE) 的抑制作用，以 KN93 作為陽(yáng)性對(duì)照 (圖 5A 和 5B)。在 10 μM 濃度下，33 個(gè)分子抑制 CaMKII-δ9 的活性超過(guò) 95%。

復(fù)篩：測(cè)試初篩獲得的 33 個(gè)分子抑制 CaMKII-δ9 激酶活性的 IC₅₀。

苗頭化合物的驗(yàn)證： 在復(fù)篩的基礎(chǔ)上，選擇 IC₅₀ 最低的前 10 個(gè)化合物 (圖 5C)，進(jìn)一步分析對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

最后作者團(tuán)隊(duì)在體外篩到具有抗腫瘤活性的 Aurora B 激酶抑制劑 Hesperadin，能夠以 ATP 競(jìng)爭(zhēng)的方式特異性的抑制心臟中 CaMKII-δ。此外，在體內(nèi)移植了人類癌細(xì)胞的 BALB/c 裸鼠模型中，Hesperadin 延緩了腫瘤的生長(zhǎng)，但沒(méi)有引起心肌細(xì)胞死亡或心臟損傷 (圖 6)。

 

圖 6. 抗腫瘤活性的 Aurora B 激酶抑制劑 Hesperadin 的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證^[5]。

A: Hesperadin 對(duì) CaMKII 亞型的 IC₅₀ 值及激酶選擇性; B: Hesperadin 顯著降低 I/R 誘導(dǎo)的心肌梗死面積; C: Hesperadin 顯著抑制腫瘤生長(zhǎng); D: Hesperadin 在心臟和腫瘤中的雙重功能。

 

文獻(xiàn)來(lái)源：Cancer Discov. 2023 Jul 7;13(7):1696-1719.

 IF=28.2 

抑癌基因 TP53 的突變體 Y107H 可增加小鼠的患癌風(fēng)險(xiǎn)，作者通過(guò) MCE 抗癌癥化合物庫(kù)  (HY-L025)，從2000多個(gè)化合物中經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩 2 次篩選，得到誘導(dǎo) Y107H 突變的 HCT116 結(jié)直腸癌細(xì)胞（克隆 A11 和 C2）優(yōu)先喪失活力的化合物，并探究 Y107H 在結(jié)腸癌中作用的潛在機(jī)制。 

候選化合物的驗(yàn)證：在篩選得到的化合物中，其中有兩個(gè)化合物是谷氨酰胺酶抑制劑 CB-839 和 BPTES，使用獨(dú)立細(xì)胞活力測(cè)定 (Alamar Blue）證實(shí)了兩個(gè)候選化合物處理細(xì)胞后，Y107H 突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞的敏感性增加 (圖 8A 和 8B)。選取 CB-839 進(jìn)行體內(nèi)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，CB-839 (200 mg/kg) 可以顯著抑制 NSG 小鼠 (移植 Y107H 細(xì)胞組) 體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)。

 

圖 8. CB-839 在 Y107H 突變結(jié)直腸癌細(xì)胞和小鼠體內(nèi)的驗(yàn)證^[6]。

A-B：CB-839或 BPTES處理Y107H 突變的結(jié)直腸癌細(xì)胞 72 小時(shí)的 IC₅₀ 分析；C-D：CB-839 對(duì)有 WT p53 或 Y107H 克隆 A11 的 NSG 小鼠中腫瘤生長(zhǎng)的影響。

 

得到了先導(dǎo)化合物，也可以對(duì)結(jié)構(gòu)做進(jìn)一步優(yōu)化以促進(jìn)藥物更好的發(fā)揮作用。整個(gè)實(shí)驗(yàn)做完，下一步就可以整理數(shù)據(jù)補(bǔ)充到你待發(fā)表的文章了！高分在向你招手呢

作為全球領(lǐng)先的科研化學(xué)品和生物活性化合物供應(yīng)商，MCE 目前可提供 200+ 種即用型活性化合物庫(kù)，總計(jì) 20,000+ 具有生物活性的小分子化合物，可用于高通量篩選 (HTS) 和高內(nèi)涵篩選 (HCS)，是進(jìn)行新藥篩選和新適應(yīng)癥發(fā)現(xiàn)等研究的專業(yè)工具!  
小M 溫馨提示：開(kāi)學(xué)季，化合物庫(kù)有大折扣呦，歡迎關(guān)注~

生物活性化合物庫(kù)

這類化合物一般比較容易透過(guò)細(xì)胞膜，作用于細(xì)胞內(nèi)特定的靶蛋白，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路，進(jìn)而引起細(xì)胞表型的一些變化。20,000+ 種具有明確報(bào)道的、活性已知、靶點(diǎn)明確的小分子化合物，產(chǎn)品數(shù)量多，靶點(diǎn)全面，涉及的信號(hào)通路廣泛，可以用于信號(hào)通路研究以及新藥研發(fā)等。

老藥新用化合物庫(kù)

新藥研發(fā)是一個(gè)耗時(shí)且成本高昂的研發(fā)過(guò)程，大量潛在藥物從未進(jìn)入臨床測(cè)試，即使化合物進(jìn)入臨床開(kāi)發(fā)，最終也只有不到 15% 獲得批準(zhǔn)，所以藥物重新利用是有吸引力且務(wù)實(shí)的[7]。批準(zhǔn)上市藥物及通過(guò)臨床 I 期的化合物由于具有良好的生物活性、藥代動(dòng)力學(xué)特性和安全性，這可以降低藥物研發(fā)失敗風(fēng)險(xiǎn)，縮短研發(fā)周期，降低研發(fā)成本。MCE 收錄了 5,000+ 藥物，適合藥物新適應(yīng)癥的研究。

天然產(chǎn)物庫(kù)

天然產(chǎn)物是自然界中產(chǎn)生的，包括初級(jí)代謝物及次級(jí)代謝物。天然產(chǎn)物及其衍生物仍然在全球批準(zhǔn)的藥物中占很大比例，但是如圖 9 所示，天然產(chǎn)物在高通量篩選中可能未得到充分利用[8]。所以，天然產(chǎn)物具有的生物多樣性以及潛在生物活性，是藥物發(fā)現(xiàn)中先導(dǎo)化合物開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。MCE 收錄了 5,000+ 天然產(chǎn)物，來(lái)源豐富，結(jié)構(gòu)多樣，是先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源。

中藥單體化合物庫(kù)

中草藥成分作為中藥的基石，具有廣泛的化學(xué)結(jié)構(gòu)多樣性和高選擇性，被認(rèn)為是分子設(shè)計(jì)的理想起點(diǎn)。據(jù)估計(jì)，全球已批準(zhǔn)的小分子臨床藥物中不少于 50% 是直接或間接源自草藥成分的[9]。中藥單體是中草藥中的活性成分，具有多種藥用特性，如抗氧化，抗癌，抗菌等作用，是新藥開(kāi)發(fā)的重要來(lái)源。MCE 收錄了 3,000+ 中草藥來(lái)源的單體化合物，是篩選中藥來(lái)源藥物的有用工具。 

片段化合物庫(kù)

基于片段的藥物開(kāi)發(fā) (FBDD) 通常從與靶標(biāo)結(jié)合親和力低、化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜性低、分子量低 (≤300 Da) 的化學(xué)片段開(kāi)始生成化合物，非常適合先導(dǎo)化合物及功能探針的發(fā)現(xiàn)。片段化合物可以覆蓋廣闊的化學(xué)空間，節(jié)省實(shí)驗(yàn)成本、提供多樣化的命中[10]。MCE 收錄了 22,000+ 片段化合物，均符合“類藥 3 原則 (RO3)”，即分子量 ≤300 Da，氫供體 (H-donors)≤3，氫受體 (H-acceptors)≤3，cLogP≤3。

 

當(dāng)然，MCE 也一直在為全球客戶助力科研！我們擁有已知活性庫(kù)、類藥多樣庫(kù)、特色片段庫(kù)及藥物篩選、先導(dǎo)化合物優(yōu)化平臺(tái)，為全球科研客戶及新藥研發(fā)客戶提供一站式藥物發(fā)現(xiàn)及研究服務(wù)。如果你有想法，歡迎來(lái)詢~

 

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[1] J P Hughes, et al. Principles of early drug discovery. Br J Pharmacol. 2011 Mar;162(6):1239-49.
 
 
[2] Michael Entzeroth, et al. Overview of high-throughput screening. Curr Protoc Pharmacol. 2009 Mar;Chapter 9:Unit 9.4.
 
[3] Paweł Szymański, Magdalena Markowicz, et al. Adaptation of High-Throughput Screening in Drug Discovery-Toxicological Screening Tests. Int J Mol Sci. 2012; 13(1): 427–452.
 
[4] Hasan Aldewachi, et al. High-Throughput Screening Platforms in the Discovery of Novel Drugs for Neurodegenerative Diseases. Bioengineering (Basel). 2021 Feb 23;8(2):30.
 
[5] Junxia Zhang, et al. Novel CaMKII-δ Inhibitor Hesperadin Exerts Dual Functions to Ameliorate Cardiac Ischemia/Reperfusion Injury and Inhibit Tumor Growth. Circulation. 2022 Apr 12;145(15):1154-1168.
 
[6] Alexandra Indeglia, Jessica C Leung, et al. An African-Specific Variant of TP53 Reveals PADI4 as a Regulator of p53-Mediated Tumor Suppression. Cancer Discov. 2023 Jul 7;13(7):1696-1719.
 
[7] Steven M Corsello, et al. The Drug Repurposing Hub: a next-generation drug library and information resource. Nat Med. 2017 Apr 7;23(4):405-408.
 
[8] Brice A P Wilson, et al. Creating and screening natural product libraries. Nat Prod Rep. 2020 Jul 1;37(7):893-918.
 
[9] Liu-Xia Zhang, et al. TCMSID: a simplified integrated database for drug discovery from traditional chinese medicine. J Cheminform. 2022 Dec 31;14(1):89.
 
[10] Qingxin Li, et al. Application of Fragment-Based Drug Discovery to Versatile Targets. Front Mol Biosci. 2020 Aug 5;7:180.