小核酸藥物評(píng)價(jià)模型—B6-hSMN2(SMA)小鼠的介紹

本次和大家見(jiàn)面的是脊髓性肌萎縮癥（SMA）模型——B6-hSMN2(SMA)小鼠，先讓小賽帶大家了解一下SMA。

SMA是由脊髓前角細(xì)胞運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性引起的常染色體隱性遺傳病，以嚴(yán)重進(jìn)行性肌無(wú)力和肌萎縮為特征，是嬰幼兒期常見(jiàn)的致死性罕見(jiàn)遺傳病。SMA全球發(fā)病率為1/6,000~1/10,000，在罕見(jiàn)病中屬較高水平，也被稱(chēng)為罕見(jiàn)病中的“常見(jiàn)病”^[1]。

多數(shù)SMA由SMN1突變導(dǎo)致
SMA與生存運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元（SMN）蛋白有關(guān)，該蛋白缺乏會(huì)在脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元中導(dǎo)致廣泛的剪接缺陷和功能缺失。人體SMN編碼基因分為SMN1和SMN2，SMN1通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯生成完整功能性蛋白，是體內(nèi)SMN蛋白的主要來(lái)源。SMN2與SMN1高度保守，但在7號(hào)外顯子剪接增強(qiáng)子處存在一個(gè)核苷酸差異，導(dǎo)致生成的多數(shù)SMN2 mRNA缺少第7個(gè)外顯子，編碼功能缺失的SMN截?cái)嗟鞍祝�并在�?xì)胞內(nèi)迅速降解^[2,3]。僅有部分SMN2 Pre-mRNA（10~15%）能被剪切為全長(zhǎng)mRNA，編碼具有正常功能的SMN蛋白（圖1）。
 

圖1 SMN2基因編碼的少量功能性SMN蛋白無(wú)法完全代償SMN1基因的缺失^[3]

約95%的SMA患者攜帶SMN1第7號(hào)外顯子純合缺失突變或使SMN1轉(zhuǎn)為SMN2的突變，SMN2表達(dá)無(wú)法代償體內(nèi)SMN蛋白的缺失，進(jìn)而影響運(yùn)動(dòng)、呼吸和吞咽并累及脾臟、心臟和胰腺等器官，甚至威脅生命。在SMN1缺失的情況下，根據(jù)患者體內(nèi)SMN2的拷貝數(shù)，可將SMA分為0~Ⅳ型。Ⅰ型SMA患者具有2個(gè)SMN2拷貝，Ⅱ型SMA患者具有3個(gè)SMN2拷貝，Ⅲ型和Ⅳ型SMA患者具有更多SMN2拷貝。一般來(lái)講，患者體內(nèi)SMN2拷貝數(shù)越多，疾病的嚴(yán)重程度越低，Ⅰ型SMA是較為嚴(yán)重的亞型，約占SMA總?cè)巳旱?0%^[4-5]。

SMA模型的構(gòu)建策略
根據(jù)小鼠SMN基因特性（僅存在Smn1基因）和多數(shù)SMA的遺傳特性（SMN2不能代償SMN1的缺失），賽業(yè)生物將小鼠Smn1基因原位替換為人類(lèi)SMN2基因，構(gòu)建了SMN1缺失并表達(dá)人源SMN2（hSMN2）的Ⅰ型SMA模型（圖2）。
 

圖2 B6-hSMN2(SMA)小鼠基因編輯策略

這種策略模擬大部分SMA的遺傳特性，即SMN1純合缺失和SMN2雙拷貝。與敲除小鼠Smn1基因，并通過(guò)轉(zhuǎn)基因隨機(jī)插入若干拷貝SMN2基因的傳統(tǒng)策略相比，這種策略不存在SMN2基因隨機(jī)插入，小鼠擁有清晰的SMN2基因拷貝數(shù)并能穩(wěn)定遺傳，符合大多數(shù)SMA的情況。此外，本模型可以與在6號(hào)染色體插入SMN2基因的Rosa26-hSMN2小鼠交配，增加小鼠體內(nèi)SMN2拷貝以模擬不同SMA亞型。

B6-hSMN2(SMA)小鼠表達(dá)人源SMN2基因，不表達(dá)小鼠Smn1基因
與野生型對(duì)照組（B6N）相比，純合B6-hSMN2(SMA)小鼠不表達(dá)小鼠Smn1 mRNA（圖3 d），其體內(nèi)同時(shí)存在缺少7號(hào)外顯子（E7-）及包含7號(hào)外顯子（E7+）的人類(lèi)SMN2轉(zhuǎn)錄本（圖3 a-b），SMN2 E7+轉(zhuǎn)錄本僅占總SMN2轉(zhuǎn)錄本（E7+&E7-）的極少部分（圖3 c）。
 

圖3 3周齡B6-hSMN2(SMA)小鼠和野生型小鼠（B6N）基因表達(dá)檢測(cè)

B6-hSMN2(SMA)小鼠缺乏SMN蛋白
基因的改變影響了SMN蛋白水平，與野生型相比，純合B6-hSMN2(SMA)小鼠脊髓、心臟、骨骼肌、腦部、肝臟和腎臟中僅存在少量由SMN2基因編碼的SMN蛋白（圖4），這與人類(lèi)SMA患者體內(nèi)的蛋白表達(dá)模式相似。
 

圖4 3周齡野生型小鼠（C57BL/6N）和 B6-hSMN2(SMA)小鼠體內(nèi)SMN蛋白檢測(cè)

B6-hSMN2(SMA)小鼠呈現(xiàn)多組織病理
組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明，純合B6-hSMN2(SMA)小鼠顯示出肌細(xì)胞壞死和萎縮、胞質(zhì)崩解、淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和肌細(xì)胞間隔增寬/排列疏松等肌肉組織病理，局部肌纖維壞死溶解/結(jié)構(gòu)消失、結(jié)締組織增生、粒細(xì)胞浸潤(rùn)、掌骨斷裂和皮下水腫等腳掌和腳趾病理，以及局部皮下水腫、結(jié)締組織排列疏松、血管擴(kuò)張、肌細(xì)胞萎縮并伴有少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等尾部病理（圖5）。
 

圖5 3周齡純合B6-hSMN2(SMA)小鼠肌肉、腳掌和尾部可見(jiàn)明顯病理表型

B6-hSMN2(SMA)小鼠存在嚴(yán)重發(fā)育缺陷和漸進(jìn)性疾病進(jìn)程
SMN蛋白的缺失導(dǎo)致B6-hSMN2(SMA)小鼠發(fā)育出現(xiàn)缺陷，表現(xiàn)為肌肉萎縮、站立不穩(wěn)、體型較小、身長(zhǎng)較短、斷尾和四肢浮腫等嚴(yán)重表型（圖6）。
 

圖6 3周齡雜合B6-hSMN2(SMA)小鼠（hSMN2/+）和純合B6-hSMN2(SMA)小鼠（hSMN2/hSMN2）外觀

此外，純合B6-hSMN2(SMA)小鼠在第20天左右開(kāi)始死亡，30天左右達(dá)到半數(shù)致死率。存活的純合B6-hSMN2(SMA)小鼠在30日齡左右出現(xiàn)腳趾壞死和完全斷尾的現(xiàn)象，50日齡左右出現(xiàn)耳朵壞死，66日齡耳朵周?chē)�毛發(fā)變白（圖7）。雜合B6-hSMN2(SMA)小鼠與野生型相似，無(wú)異常情況，符合SMA患者的常染色體隱性遺傳模式。
 

圖7 B6-hSMN2(SMA)小鼠生存曲線和疾病進(jìn)程

小核酸藥物減輕B6-hSMN2(SMA)小鼠疾病表型并提高生存率
目前有Zolgensma、Spinraza和Evrysdi三款SMA藥物獲批上市。Spinraza為首款獲批藥物，通過(guò)反義寡核苷酸（ASO）修飾SMN2 mRNA的剪切模式，使其生成大量包含7號(hào)外顯子的正常SMN2 mRNA以編碼功能性SMN蛋白，這也是SMA治療的主要方向之一^[3]。以Spinraza公開(kāi)信息為基礎(chǔ)合成與其結(jié)構(gòu)和功能類(lèi)似的反義寡核苷酸（ASO10-27，由GenScript合成），并以腦室內(nèi)注射（icv）和皮下注射（s.c.）的方式分別給予B6-hSMN2(SMA)小鼠不同劑量的ASO10-27。數(shù)據(jù)顯示，腦室內(nèi)注射（icv）的ASO可以增加B6-hSMN2(SMA)小鼠腦部SMN蛋白表達(dá)量（圖8 a）和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元個(gè)數(shù)（圖8 b）。
 

圖8 靶向SMN2的ASO對(duì)B6-hSMN2(SMA)小鼠SMN蛋白和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的影響

通過(guò)腦室內(nèi)注射（icv）方式給藥的B6-hSMN2(SMA)小鼠生存率明顯提升，小鼠在78日齡仍保持存活。未經(jīng)ASO治療的B6-hSMN2(SMA)小鼠在35日齡出現(xiàn)腳趾壞死和斷尾，ASO治療組小鼠僅在43日齡出現(xiàn)腳趾輕微腫脹，未見(jiàn)腳趾壞死且尾巴尚存。在78日齡，部分ASO處理組小鼠才出現(xiàn)斷尾現(xiàn)象，但仍未見(jiàn)腳趾壞死（圖9）。
 

圖9 ASO處理提升B6-hSMN2(SMA)小鼠存活率并延緩組織病變

總 結(jié)
綜上所述，B6-hSMN2(SMA)小鼠表達(dá)人類(lèi)SMN2基因，并存在SMN2 mRNA的選擇性剪切，這導(dǎo)致小鼠體內(nèi)SMN蛋白的缺失，引起與經(jīng)典SMA模型相似的表型。ASO、siRNA和miRNA等小核酸作為最近幾年快速發(fā)展新興藥物，因其通過(guò)靶向mRNA而非基因來(lái)治療疾病，不存在遺傳風(fēng)險(xiǎn)，因此受到眾多關(guān)注，尤其是遺傳性罕見(jiàn)病領(lǐng)域。B6-hSMN2(SMA)小鼠模擬人類(lèi)SMA的遺傳機(jī)制和疾病進(jìn)程，對(duì)靶向SMN2的ASO藥物具有良好響應(yīng)，表明本模型可用于靶向SMN2的小核酸及其它類(lèi)型藥物的開(kāi)發(fā)、篩選和評(píng)價(jià)等研究。