應(yīng)用分享：高通量電穿孔系統(tǒng)助力體外基因編輯、新藥開(kāi)發(fā)、新冠研究

 

電穿孔方法進(jìn)行T細(xì)胞基因編輯的瓶頸：電穿孔技術(shù)在以往研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)加入長(zhǎng)的雙鏈DNA以及濃度非常高的情況下，會(huì)對(duì)細(xì)胞造成很高的毒性引發(fā)細(xì)胞死亡，短的單鏈DNA就不會(huì)。
 

Theo及其團(tuán)隊(duì)選擇Lonza 96 shuttle高通量電穿孔系統(tǒng)對(duì)CRISPR與DNA的比例、細(xì)胞培養(yǎng)的不同方式、不同強(qiáng)度的電脈沖等參數(shù)進(jìn)行摸索優(yōu)化，很好的解決了雙鏈DNA對(duì)細(xì)胞毒性大的問(wèn)題。Theo等從健康人體內(nèi)獲得T細(xì)胞，利用Lonza Nucleofector技術(shù)更換了T細(xì)胞的TCR，使這些細(xì)胞能夠特異性地攻擊人黑色素瘤細(xì)胞。

 

二，新藥開(kāi)發(fā)—全基因組陣列CRISPR-Cas9篩選

2019年，GSK（英國(guó)葛蘭素史克公司GlaxoSmithKline）公司與加州大學(xué)創(chuàng)建了基因組研究實(shí)驗(yàn)室（LGR）。

SLAS2020國(guó)際會(huì)議與展覽在T細(xì)胞中進(jìn)行陣列CRISPR-Cas9基因編輯篩選的384孔工作流程。

 

基于這一用于T細(xì)胞篩選的小型、穩(wěn)健的高通量電轉(zhuǎn)染方案和分析，GSK成功解決了原代T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染難題，并展示了全基因組陣列CRISPR-Cas9篩選在原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染中的潛力。

三，新冠研究—高通量CRISPR篩選

加州大學(xué)舊金山分校的研究團(tuán)隊(duì)使用Lonza 384-well Nucleofector™ 來(lái)進(jìn)行陣列CRISPR篩選，以識(shí)別增強(qiáng)或抑制新冠病毒感染的宿主蛋白。

 

 

Comparative host-coronavirus protein interaction networks reveal pan-viral disease mechanisms[J]. Science (New York, N.Y.), 370(6521):eabe9403.

四，新冠研究—高通量CRISPR篩選

巴斯德研究所的研究團(tuán)隊(duì)同樣應(yīng)用到了Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進(jìn)行高通量的CRISPR/Cas9篩選，評(píng)估了1905個(gè)ISG（IFN stimulated genes）在人肺上皮細(xì)胞中調(diào)節(jié)SARS-Cov-2復(fù)制的能力。
 

 

 

Mac Kain, A., Maarifi, G., Aicher, S. et al. 2021. Identification of DAXX As A Restriction Factor Of SARS-CoV-2 Through A CRISPR/Cas9 Screen.

五，siRNA篩選靶點(diǎn)——開(kāi)發(fā)腦瘤候選藥物

丹麥癌癥協(xié)會(huì)研究中心的研究人員基于Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進(jìn)行了高通量siRNA文庫(kù)篩選，采用的siRNA庫(kù)包含296個(gè)基因靶點(diǎn)，陽(yáng)性對(duì)照（INCENP9）和陰性對(duì)照(siRNA的加擾對(duì)照)，每個(gè)基因設(shè)計(jì)了3個(gè)獨(dú)立的 siRNA。基于此，研究人員發(fā)現(xiàn)了膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的潛在靶點(diǎn)——SPT6，并證實(shí)了SPT6丟失誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSB）是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤特異性的。
 

 

 

Obara E , Aguilar-Morante D , Rasmussen R D , et al. SPT6-driven error-free DNA repair safeguards genomic stability of glioblastoma cancer stem-like cells[J]. Nature Communications, 2020, 11(1):4709.

六，原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染——特發(fā)性肺纖維化治療

阿斯利康采用Lonza原代細(xì)胞，IPF肺成纖維細(xì)胞，探索了IPF(特發(fā)性肺纖維化Idiopathic Pulmonary Fibrosis,IPF)的關(guān)鍵疾病驅(qū)動(dòng)機(jī)制。在這項(xiàng)研究中，Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)成功對(duì)原代健康人類(lèi)肺成纖維細(xì)胞的第2代細(xì)胞進(jìn)行了CRISPR-Cas9 RNP轉(zhuǎn)染遞送。研究結(jié)果證明了PPP1R15A在調(diào)節(jié)肺間充質(zhì)細(xì)胞中的主要作用，并且提示了特發(fā)性肺纖維化的一種新治療策略。
 

 

 

Monkley S , Overed-Sayer C , Parfrey H , et al. Sensitization of the UPR by Loss of PPP1R15A Promotes Fibrosis and Senescence in IPF[J]. Scientific Reports.

七，多質(zhì)粒的高通量電穿孔，優(yōu)化CRISPR堿基編輯

上海交通大學(xué)童垚俊教授團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一種基于CRISPR-Prime編輯技術(shù)的通用（無(wú)雙鏈斷裂）原核生物遺傳操作工具箱，通過(guò)Lonza 384-well Nucleofector™ 系統(tǒng)進(jìn)行高通量的多質(zhì)粒電穿孔，實(shí)現(xiàn)了大腸桿菌的質(zhì)粒和染色體的基因敲除、敲入、敲低、單堿基替換和組合編輯。
 

 

 

Tong, Y., Jørgensen, T.S., Whitford, C.M. et al. A versatile genetic engineering toolkit for E. coli based on CRISPR-prime editing. Nat Commun 12, 5206 (2021)