一次性生物反應器放大工藝介紹

1.介紹

利用攪拌式生物反應器(STR)在哺乳動物細胞培養(yǎng)中產生許多治療性蛋白質(例如，單抗、融合蛋白、酶)。生物反應器提供了對最佳細胞生長和蛋白質生產的關鍵參數的控制，如溫度、溶解氧(DO)和pH。根據產品和工藝的特點，重組蛋白的生產有多種細胞培養(yǎng)方法，包括分批、重復分批、補料分批和灌流。還使用了系列細胞類型(如CHO、NS0、BHK、PER.C6)。其中CHO是最廣泛使用的。在小規(guī)模生物反應器中開發(fā)制造工藝，然后擴大到所需的大規(guī)模生產制造規(guī)模。生產規(guī)模由市場需求和工藝經濟決定。目前，高達10,000-25,000L的大型生物反應器通常用于基于哺乳動物細胞培養(yǎng)的生物制劑生產。由于所需的流體動力學條件和培養(yǎng)需求的差異，細胞培養(yǎng)生物反應器與微生物生物反應器的設計和放大可能有很大不同。

在過去的幾十年里，對生物反應器放大的了解一直在穩(wěn)步增加，但大型生物反應器由于其在混合和傳質方面的局限性，本質上更難操作。隨著生物反應器規(guī)模的增加，混合時間的增加，都是生物反應器操作和規(guī)模平移中的一個挑戰(zhàn)。此外，細胞、培養(yǎng)基和工藝的改進將細胞密度推到了更高的水平，從而對擴大規(guī)模提出了新的挑戰(zhàn)。

近年來，一次性生物反應器在國內外得到廣泛應用，一次性生物反應器已迅速應用于臨床生產，并正在進入商業(yè)生產。艾貝泰生物科技有限公司現提供多種型號的一次性生物反應器。反應器中空袋主要由塑料制成，設計為一次性使用，從而消除了不銹鋼(SS)設計的原位清洗(CIP)和原位滅菌(SIP)方面的問題。一次性生物反應器的使用是由改進的細胞培養(yǎng)過程和設施經濟帶來的產品高濃度驅動的。放大方法和操作與不銹鋼生物反應器有很大的相似之處。但是具有獨特的操作問題，例如袋壓和混合，討論了這些方面對放大的影響。
 

2.工程參數

表1列出了哺乳動物培養(yǎng)中通常認為的工程參數，隨后詳細描述了不同的參數。一些參數，如單位體積功率輸入(P/V)和流量數(F1)取決于流型，并給出了假設完全湍流的表達式。表中還顯示了不同參數之間的相互依賴關系。
 

表1—使用不同標準從3L生物反應器放大到20,000L生物反應器。

原文提供了詳細的工程參數計算方式和含義的說明，本文不進行贅述。
 

2.1氣體傳輸

（1）O₂供應:細胞培養(yǎng)上清液與空氣平衡時的氧氣濃度約為0.19 mM。細胞比氧攝取率(qO2)為4 pmol/cell/day，細胞密度為10⁹/ml的培養(yǎng)物在幾分鐘內就會消耗掉氧氣。因此，必須不斷地向培養(yǎng)物供應氧氣。使用空氣或氧氣時，氧氣的體積傳質系數Kla(由氧氣傳遞率(OTR定義)需要約為2h^-1‬才能支持該培養(yǎng)。
 

圖1細胞比氧攝取率(qO2)在1-10 pmol/cell/day范圍內的哺乳動物細胞的估計Kla需要量。
 

（2）CO₂供應: 通過逸度(pCO₂)來描述的溶解CO₂水平的控制，在細胞培養(yǎng)過程中與碳酸氫鹽(HCO)的解離平衡中也是至關重要的。高溶解CO₂水平會抑制細胞生長，產生代謝壓力，甚至導致細胞死亡，影響培養(yǎng)效率和產品質量。低溶解CO₂水平也可以減緩生長和影響性能，因為HCO₃^-介導了一些細胞過程，如戊糖磷酸途徑和補充復變中間體。培養(yǎng)物中的細胞也通過兩種機制影響溶解的CO₂水平。第一種是細胞的有氧呼吸，呼吸商RQ=CER/OUR約為0.8至1。第二個經常被忽視的是培養(yǎng)物產生的酸，主要是乳酸，它通過以下反應與培養(yǎng)物中的重碳酸鹽反應：

 

在許多培養(yǎng)開始時，當細胞密度低，乳酸產量高時，這種機制產生的二氧化碳可以超過有氧呼吸產生的CO₂。該反應還將HCO₃^-轉化為CO₂‬，對pH的影響比單獨產生二氧化碳的影響更大。為了保持恒定的pH值，要么必須添加堿，要么需要非常有效地去除CO₂。

（3）氣體傳遞技術和氣體傳遞系數的確定: 細胞培養(yǎng)最常用的兩種技術是小型生物反應器的表面轉移和用于大型生物反應器的直接通氣。

O₂的氣體傳遞系數Kla通常是通過經典的瞬時放氣方法測量的，即用N₂降低DO水平，然后用空氣或氧氣來提高DO水平。在N₂剝離和Air/O₂通氣過程中，都可以使用與氣體平衡的適當O₂濃度；N₂為0，Air為0.19 mM，O₂為0.9 mM，來估算Kla。為了計算Kla，假定氣體和液體和塞狀流是完全混合的。在細胞存在的情況下，通過停止Air或O₂通入并允許DO下降到較低水平來測量它。

CO₂‬氣體傳遞系數kla，由于CO2‬的高溶解度，氣體在生物反應器中上升時會與介質中的CO_2‬平衡。CO₂‬的實際去除取決于通氣中CO_2‬的平衡程度。

從實驗室規(guī)模的生物反應器到中試和大型的生物反應器的放大會導致氣體轉移過程中的損失。這會隨著規(guī)模的擴大而影響培養(yǎng)物的O₂和CO₂水平。假設培養(yǎng)物消耗或生產相同，對于較大的生物反應器，除了最低密度的培養(yǎng)物外，表面氣體對O₂的轉移是不夠的。對于CO₂，在從實驗室規(guī)模擴大的過程中，CO₂表面去除的損失是造成CO₂積累的主要因素。Air通常在放大中對Sparger設計的更改以彌補損失。

2.2攪拌

攪拌最常見的放大標準是P/V如前所述。按比例放大會導致P/V隨著V^5/3的增加而增加，這涉及到使用比在實驗規(guī)模下使用的高徑比更高的容器，也就是說，在可用的設備下，尺寸上的相似性通常是不可行的。如果不使用多個葉輪，這對混合時間有負面影響。超過1:1的H:T(生物反應器高度:生物反應器直徑)比，對t_m∝(H/T)^2.5有很強的依賴性。使用多個葉輪時，可以從單獨的混合區(qū)進行較慢的混合。P/V與混合時間有關，因此代表均勻化速率。P/V 也與平均P/V相關，因此代表了潛在的水動力損傷。它是一個比例如葉尖速度更合適的比例放大。特別是按葉頂速度放大會導致混合時間過差。雖然P/V是一個很好的放大標準，但也具有一定的風險。
 

3.放大過程中葡萄糖代謝溢出

雖然在哺乳動物細胞培養(yǎng)放大過程中很少觀察到葡萄糖代謝溢出，但有注意到葡萄糖/乳酸代謝隨規(guī)模的增加而變化的情況，在擴大規(guī)模期間觀察到葡萄糖消耗和乳酸生成率的增加。雖然葡萄糖代謝溢出的原因可能有所不同，可以肯定的是，葡萄糖代謝效率低下與培養(yǎng)性能受損有關。葡萄糖和乳酸代謝的這種變化導致額外的堿添加和滲透壓增加，這兩者都可能對工藝性能產生負面影響。
 

4.高密度培養(yǎng)

隨著高灌流率和中空纖維過濾裝置的應用，在灌注培養(yǎng)中可以達到非常高的密度，達到 50 ~ 100 × 10^{^6}cells/mL，甚至更高。例如，使用切向流過濾系統(tǒng)可達到 214 × 10^{^6}cells/mL的 CHO 細胞密度，使用交替切向流系統(tǒng)可達到 132×10^{^6}cells/ mL。細胞密度增大的同時，粘度也會增大，可能在影響工藝性能。
 

5.規(guī)�；�的一次性生物反應器設計

大多數一次性生物反應器的設計方式類似于標準的圓柱形SS攪拌生物反應器。葉輪和電機的位置根據設計而有所不同，其中使用頂部或底部安裝的電機。攪拌是由預先安裝的葉輪提供的，這些葉輪附著在頂部或通過支撐基座。生物反應器內的 pH、DO、溫度等監(jiān)測采用與傳統(tǒng) SS 罐類似的探針和技術。除了圓柱形攪拌槽外，還開發(fā)了采用不同幾何形狀和/或攪拌和混合機制的替代一次性生物反應器系統(tǒng)。

放大一次性反應器采用與不銹鋼生物反應器類似的方法，例如，P/V仍然是反應器的推薦放大標準。反應器中的細胞培養(yǎng)性能已被證明與使用類似放大標準的不銹鋼生物反應器中的細胞培養(yǎng)性能相當。

生物反應器壓力:不銹鋼生物反應器通常在正壓下運行;在SS系統(tǒng)中可以壓力增加，但在一次性反應系統(tǒng)中則不能。相反，SUBs中的壓力被密切監(jiān)測，以避免袋壓過壓(例如，某些系統(tǒng)<1psi;當壓力超過最大允許值時，系統(tǒng)關閉控制器。

雙曝氣系統(tǒng):為了實現所需的氧氣傳遞和二氧化碳去除，通常使用雙曝氣系統(tǒng)，包括毫米孔徑的通氣口(如鉆孔，用于空氣/N₂)和微米孔徑的通氣口(如燒結口，用于O₂/CO₂)。雖然雙通氣口也用于SS生物反應器，但毫米孔徑的分散器與顆粒分散器的組合在一次性反應器中更為普遍。

這些通氣口產生的氣泡直徑只有幾到幾十毫米;通常認為，在正常的PF68濃度下，它們對細胞健康的風險很低，甚至沒有風險。由于這些生物反應器一次性袋是定制的，因此可以定制分散器設計以滿足特定的工藝需求。

在使用時，生物反應器PID控制回路的調整可能會更加復雜。
 

6.一次性生物反應器混合性能的改進

在典型的放大標準下，隨著生物反應器規(guī)模的增加而增加，這將增加大型生物反應器中添加極端pH值溶液時的pH非均質性。混合的改進有望進一步提高工藝性能，因為混合不充分會導致局部pH梯度，會對哺乳動物培養(yǎng)物的性能產生負面影響�？梢酝ㄟ^優(yōu)化葉輪配置、生物反應器長徑比和擋板設計來優(yōu)化。艾貝泰生物科技有限公司自研的一次性生物反應器是立方體設計，具有天然擋板，增加了生物反應器內的湍流，在使用過程中具有優(yōu)越的混合時間數據，在最低攪拌轉速時，混合時間改善明顯，將對整體培養(yǎng)性能產生積極影響。同樣支持細胞生長和蛋白質生產。由于具有諸如改善混合條件或降低剪切等額外好處，其中一些設計可以很好地滿足特定的工藝需求。
 

7.總結

雖然細胞培養(yǎng)生物反應器放大方法在過去十年中已經相對成熟，但仍在尋求進一步優(yōu)化的改進。部分原因是由于生物反應器設計的局限性，由于氣體傳輸和混合限制，歷史設計可能不適合新工藝的采用。使放大性能進一步復雜化的是，許多“放大”挑戰(zhàn)是由不同規(guī)模的生物反應器設計差異驅動的。盡管有各種各樣的分散器和葉輪設計可供選擇，但改造現有設施以適應不同的工藝/產品開發(fā)環(huán)境并非易事。放大性能受損通常是由于設備的差異和限制。

作為一次性應用系統(tǒng)中極為重要的產品體系，隨著國內生物制藥行業(yè)近年來的高速發(fā)展，越來越多的用戶開始關注擁有更強功能性、更高效性和易用安全的一次性生物反應器。針對研發(fā)、臨床前、臨床階段以及生產階段的商業(yè)化項目，一次性反應器都獨具優(yōu)勢。艾貝泰作為國內始終致力于生物制藥行業(yè)工藝解決方案的理想供應商。