細(xì)胞自噬的監(jiān)測方法及在癌癥檢測中的應(yīng)用
今年 8 月 24 日，國家自然科學(xué)基金委員會揭曉了 2023 年國自然評審結(jié)果，自噬相關(guān)研究的中標(biāo)數(shù)量高達(dá) 518 項!（來源：ZCOOL 國自然項目查詢系統(tǒng)）
言歸正傳！自噬，一種針對細(xì)胞內(nèi)各種成分進(jìn)行降解的基本過程。誰來降解？溶酶體；降解誰？細(xì)胞內(nèi)的各類大分子和亞細(xì)胞成分，例如核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和細(xì)胞器等。
自噬可以是非選擇性的，細(xì)胞質(zhì)物質(zhì)被隔離到自噬體中進(jìn)行吞噬，通常在營養(yǎng)缺乏時發(fā)生。相比之下，選擇性自噬會降解特定靶標(biāo)，例如受損的細(xì)胞器：線粒體自噬、溶酶體自噬、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬等等，從而在細(xì)胞質(zhì)量控制中發(fā)揮重要作用 (圖 1)[1][2]。
圖 1. 不同的自噬機(jī)制及特點[2]。
自噬是一個高度集成的過程，通過促進(jìn)細(xì)胞存活或?qū)е录?xì)胞死亡來維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[3][4]。
▐ 自噬介導(dǎo)的細(xì)胞保護(hù)作用
自噬的主要功能是通過回收必要的細(xì)胞成分來促進(jìn)應(yīng)激/營養(yǎng)限制后的細(xì)胞存活。自噬由營養(yǎng)和能量應(yīng)激、缺氧、氧化還原應(yīng)激和線粒體損傷等多種刺激誘導(dǎo)[4]。
圖 2. 氧化應(yīng)激通過多種機(jī)制誘導(dǎo)自噬[5]。
(A-D): 響應(yīng)饑餓調(diào)節(jié)自噬的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑概述。(E-H)：誘導(dǎo)自噬的特定應(yīng)激途徑概述：缺氧 (E)；氧化損傷增加 (F); p53系統(tǒng)的干擾 (G)或線粒體功能障礙 (H) 誘導(dǎo)自噬的機(jī)制示意圖。
例如，當(dāng)細(xì)胞在同時缺乏營養(yǎng)和生長因子的情況下培養(yǎng)時，自噬到達(dá)最高水平[6]。而在小鼠中，饑餓 24-48 h 后，大多數(shù)組織中的大多數(shù)細(xì)胞顯示出自噬體數(shù)量增加[7]。其次，細(xì)胞必須清除受損的線粒體，以防止 ROS 積聚[5]。當(dāng)然，某些應(yīng)激途徑如中度缺氧時，也會誘導(dǎo)自噬，防止細(xì)胞死亡 (圖 2)[5][8]。
▐ 自噬誘導(dǎo)細(xì)胞死亡
自噬經(jīng)常在細(xì)胞死亡中觀察到，在某些情況下，抑制自噬可以防止細(xì)胞死亡[9]。由于不同信號通路之間的廣泛串?dāng)_，自噬的促死亡作用非常復(fù)雜[10]。
今年 3 月，Jiao Liu 等人報道了 TMEM164 在鐵死亡期間 (而不是饑餓期間) 選擇性介導(dǎo) ATG5 依賴性自噬體形成中的關(guān)鍵作用。TMEM164 通過激活自噬降解鐵蛋白 (Ferritin)、GPX4 和脂滴，以增加鐵積累和脂質(zhì)過氧化，從而促進(jìn)嗜鐵細(xì)胞的死亡。TMEM164 的缺失限制了小鼠體內(nèi)鐵死亡介導(dǎo)的細(xì)胞毒性的抗癌活性，建立了自噬依賴性鐵死亡的新模式[11]。
圖 3. TMEM164 在自噬依賴性細(xì)胞死亡中的作用[11]。
鐵死亡激活劑 (如 RSL3) 會誘導(dǎo) TMEM164 依賴性自噬體形成，導(dǎo)致抗鐵死亡調(diào)節(jié)因子 (如 GPX4、FTH1 和脂滴) 選擇性降解。
研究表明，GX15-070 可通過增加自噬體的積累來誘導(dǎo)自噬，并促進(jìn) Atg5 (自噬體膜的一個組成部分) 與壞死體 (Necrosome) 的關(guān)鍵成分，即 FADD、RIP1 和 RIP3 的相互作用，觸發(fā)壞死體在自噬體上的組裝。這導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)細(xì)胞死亡信號復(fù)合物的形成，引發(fā)壞死性細(xì)胞死亡[12]。
圖 4. GX15-070 通過促進(jìn)壞死體在自噬體上的組裝來觸發(fā)壞死性凋亡[12]。
自噬在癌癥中具有的雙重作用，具體取決于癌癥的類型和階段[10][13]。一方面，自噬可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，目前 FDA 批準(zhǔn)的唯一自噬抑制劑是 Chloroquine 和 Hydroxychloroquine[14]。另一方面，自噬可以通過自身或與其他細(xì)胞死亡途徑協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞死亡來增強(qiáng)癌癥治療的功效 (表 1)[10]。
表 1. 誘導(dǎo)自和細(xì)胞死亡的藥物治療[10]。
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隨著自噬研究熱度的增加，其相關(guān)檢測也成為科研“汪”們的密切關(guān)注。細(xì)胞自噬體的數(shù)量和自噬通量常作為細(xì)胞自噬活性水平的指標(biāo)。
▐ 監(jiān)測自噬體的數(shù)量目前使用三種主要方法來監(jiān)測自噬體的數(shù)量，包括電子顯微鏡、光學(xué)顯微鏡檢測 LC3 的亞細(xì)胞定位以及生化檢測 LC3 的膜相關(guān)形式[15]。
最傳統(tǒng)的方法是電子顯微鏡，通過觀察樣品判斷是否有自噬泡樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。電鏡下，發(fā)生自噬的細(xì)胞可見損傷的細(xì)胞器如線粒體的腫脹變性，其周圍有空泡狀雙層膜樣結(jié)構(gòu)，或雙層膜環(huán)繞線粒體形成自噬體，也可見自噬溶酶體內(nèi)最終不能降解的殘體等 (圖 5 和圖 6A)[15][16]。
圖 5. 自噬體和自溶酶體形態(tài)[15]。
其次，哺乳動物自噬蛋白 LC3 是自噬體的標(biāo)志物，可通過更廣泛使用的光學(xué)顯微鏡和生化方法所檢測。內(nèi)源性 LC3 或 GFP-LC3 通過熒光顯微鏡觀察為彌散的細(xì)胞質(zhì)池或主要代表自噬體的點狀結(jié)構(gòu) (圖 6 B-C)。▐ 監(jiān)測自噬通量
目前測量自噬通量的主要方法之一是監(jiān)測 LC3 周轉(zhuǎn)率，當(dāng)用溶酶體試劑 (如氯化銨、Chloroquine 或 Bafilomycin A1) 或溶酶體蛋白酶抑制劑 (如 E64d) 處理細(xì)胞時，LC3-II 的降解被阻斷，導(dǎo)致 LC3-II 的積累。因此，樣品之間 LC3-II 量的差異代表了被遞送到溶酶體進(jìn)行降解的 LC3 量 (圖 6D)[15]。
圖 6. 自噬體數(shù)量和自噬通量的監(jiān)測方法[15]。
其次，可以通過免疫印跡分析或流式細(xì)胞術(shù)定量或通過熒光顯微鏡定性觀察總細(xì)胞 LC3 的量，與自噬通量成反比。除了 LC3 之外，其他自噬底物的水平也可用于監(jiān)測自噬通量 (圖 6)。
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Chloroquine 是自噬 (autophagy) 和 Toll 樣受體 (TLRs) 的抑制劑。Chloroquine 有效抑制 SARS-CoV-2 (COVID-19) 感染 (EC50=1.13 μM)。 |
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Hydroxychloroquine 可以抑制 Toll 樣受體 7/9 (TLR7/9) 信號傳導(dǎo)。Hydroxychloroquine 有效抑制 SARS-CoV-2 感染。 |
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Vorinostat (SAHA) 是一種有效的，可口服的 HDAC1，HDAC2，HDAC3 (Class I)，HDAC6 和 HDAC7 (Class II) 和 Class IV (HDAC11) 的抑制劑。 |
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Sorafenib 誘導(dǎo)細(xì)胞自噬 (autophagy) 和凋亡 (apoptosis)，并具有抗腫瘤活性。Sorafenib 也是一種 ferroptosis 激動劑。 |
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Dactolisib (BEZ235) 是一種具有口服活性的、雙重的 pan-class I PI3K 和 mTOR 抑制劑。Dactolisib (BEZ235) 抑制 mTORC1 和 mTORC2。 |
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EACC 是可逆的自噬 (autophagy) 抑制劑，可阻斷自噬通量。EACC 選擇性抑制自噬體特異性的 SNARE Stx17 的易位，從而阻止自噬體與溶酶體的融合。 |
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