使用廣泛的探針捕獲精確宏基因組學(xué)(PMG)開展廢水AMR監(jiān)測
使用廣泛的探針捕獲
精確宏基因組學(xué)(PMG)開展廢水AMR監(jiān)測
Jacob Bierstedt，Morgan Roos，
Scott Kuersten，Courtney Gonzalez，
Kate Broadbent
精確宏基因組學(xué)(PMG)開展廢水AMR監(jiān)測
Jacob Bierstedt，Morgan Roos，
Scott Kuersten，Courtney Gonzalez，
Kate Broadbent
簡介
抗菌藥物耐藥性（AMR）是全球面臨的主要威脅，對人類健康和經(jīng)濟發(fā)展具有重大影響1,2。想要了解全球和地方范圍內(nèi)AMR的發(fā)生和傳播情況，需要準(zhǔn)確、標(biāo)準(zhǔn)化的AMR監(jiān)測數(shù)據(jù)。近年來，全球AMR的監(jiān)測工作有所加強。2022年，全球126個國家、地區(qū)和州加入了世界衛(wèi)生組織（WHO）全球抗微生物藥物耐藥性和使用監(jiān)測系統(tǒng)（GLASS）2。然而，迄今為止收集的大部分AMR數(shù)據(jù)均來自臨床環(huán)境中的個體樣本，且通常僅限于可培養(yǎng)的致病物種3-6。想要在個體層面進(jìn)行基因組AMR監(jiān)測需要實驗室具備極高的能力，這也是追蹤AMR傳播情況的阻礙之一4-6。
通過對廢水等環(huán)境樣本進(jìn)行基因組篩查來監(jiān)測AMR趨勢，是個體樣本檢測的替代方法，可減輕公共衛(wèi)生實驗室樣本采集的負(fù)擔(dān)，并通過標(biāo)準(zhǔn)化分析方法提供社區(qū)層面的AMR頻率和豐度信息5,6。憑借這些優(yōu)勢，基于新一代測序（NGS）的廢水AMR監(jiān)測正在迅速獲得關(guān)注，并有助于開發(fā)緩解全球AMR威脅的策略1。但是，盡管克服了個體采樣中存在的一些挑戰(zhàn)，但針對從環(huán)境來源收集的樣本，基于NGS的AMR檢測方法仍然面臨挑戰(zhàn)6。其中的一個挑戰(zhàn)是AMR序列只占環(huán)境樣本中總DNA的一小部分6。
鳥槍法宏基因組測序方法十分適用于優(yōu)先考慮AMR標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用或需要無假設(shè)微生物檢測的應(yīng)用。然而，用于環(huán)境AMR監(jiān)測的鳥槍法需要深度測序，且可能無法在廢水等復(fù)雜基質(zhì)中提供足夠的靈敏度7。靶向NGS代表了一種獨特、精確的環(huán)境AMR監(jiān)測方法7。通過探針捕獲開展靶向NGS，可以顯著增加AMR靶標(biāo)的reads，從而在降低測序深度的同時提供更高的AMR標(biāo)志物檢測靈敏度7。
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泌尿道病原體/耐藥基因檢測試劑盒（UPIP，因美納，僅供研究使用）專用于廣泛和準(zhǔn)確地檢測微生物和AMR序列。與基于鳥槍法的采樣方法相比，能夠采用較低的測序深度檢測與人類健康相關(guān)的序列。UPIP能夠靶向170多種泌尿生殖系統(tǒng)病原體和3700多種AMR標(biāo)志物，其中包括3600多種完整AMR基因，包含了綜合抗菌藥物耐藥性數(shù)據(jù)庫（CARD，版本3.2.5）8 中超過75%的AMR基因，涵蓋了美國疾病預(yù)防控制中心（CDC）9 重點列表中75%的AMR威脅以及WHO10重點列表中83%的相關(guān)基因（表1）。憑借廣泛的靶標(biāo)范圍，UPIP AMR panel可作為主要候選產(chǎn)品用于開展基于NGS的環(huán)境樣本AMR監(jiān)測。為了檢驗UPIP試劑盒在廢水AMR監(jiān)測方面的性能，我們使用NovaSeq™ 6000系統(tǒng)在兩種條件下（使用和不使用UPIP試劑盒）對廢水樣本進(jìn)行了測序，每個樣本平均生成300M條總reads，并比較了不同下采樣測序深度的AMR產(chǎn)量（表2）。
表1.UPIP靶向的CDC和WHO重點病原體。
UPIP富集顯著提高了AMR檢測效率：reads數(shù)量提高了>2500倍，
測序深度提高了>3500倍，
檢測量提高了>3倍
從短讀長測序數(shù)據(jù)中檢測AMR標(biāo)志物需要reads與AMR基因參考序列之間具有高比對覆蓋度和一致性，這取決于從樣本中生成的AMR reads產(chǎn)量、高質(zhì)量且全面的參考數(shù)據(jù)庫分析和軟件解決方案。UPIP捕獲探針旨在提高靶向AMR序列的測序產(chǎn)量，Explify UPIP數(shù)據(jù)分析BaseSpace Sequence Hub（BSSH）中提供的配套應(yīng)用程序旨在生成具有高覆蓋度和高一致性的共有序列和比對，從而準(zhǔn)確檢測AMR標(biāo)志物。
我們使用Explify應(yīng)用程序（v1.0.0）的樣本組成功能估計了AMR序列（在使用及未使用UPIP檢測的條件下）的測序reads比例。Explify樣本組成功能使用基于kmer的方法將reads分為各種類別，例如“人類”、“細(xì)菌”或“AMR”。UPIP檢測樣本中CARD（版本3.2.5）AMR序列的reads中值為50%，而鳥槍法樣本的reads中值為0.02%。即使測序深度降低30倍，通過UPIP檢測，AMR類別的序列reads比例也高出2500倍（圖1）。平均而言，UPIP檢測樣本5M條總reads中有2.4M條屬于AMR序列，而鳥槍法樣本150M條總reads中有0.03M條屬于AMR序列�？傊�，UPIP檢測產(chǎn)生了更多分屬于AMR序列的reads，能夠支持下游檢測算法。
圖1B：使用基于kmer的reads分類時，UPIP富集樣本（總reads：5M）與鳥槍法樣本（總reads：150M）的樣本組成。左圖顯示的是UPIP靶向序列的總樣本reads的百分比。右圖顯示的是非UPIP靶向序列的總樣本reads的百分比。CARD（版本3.2.5）中75%的AMR基因是UPIP的靶標(biāo)。
我們接著研究了reads比對指標(biāo)，評估UPIP富集對AMR標(biāo)志物reads深度、檢測和覆蓋度的直接影響。UPIP富集樣本（總reads為10M）中檢測到的AMR標(biāo)志物的讀取深度中值比reads總數(shù)達(dá)10倍以上的鳥槍法樣本（總reads為100M）高379倍。采用相同的測序深度，UPIP富集的reads深度中值提高了3783倍（圖2）。此外，UPIP樣本中檢測到的AMR標(biāo)志物數(shù)量是鳥槍法樣本的三倍，reads總數(shù)為50M（圖3A），并且檢測到的具有100%比對覆蓋度的AMR標(biāo)志物占比也明顯更高。UPIP樣本中，檢測到的AMR標(biāo)志物中達(dá)到100%覆蓋度的占90.5%，reads總數(shù)為10M，而鳥槍法樣本中的這一比例為63.7%，reads總數(shù)為100M（圖3B）。
圖2B：UPIP樣本與鳥槍法樣本的中位reads深度的增加倍數(shù)。虛線表示平均中位reads深度。
圖3B：在UPIP樣本和鳥槍法樣本中，比對覆蓋度占序列長度的比例。
UPIP檢測法提高了AMR變異檢出能力
提高AMR測序效率對于準(zhǔn)確檢測低豐度AMR標(biāo)志物和AMR標(biāo)志物變異至關(guān)重要。因此，我們研究了UPIP檢測法對AMR標(biāo)志物變異檢測的影響。Explify應(yīng)用程序在所有UPIP樣本（5M至50M條reads）中檢測到了glpT基因中的E448K突變11。對于鳥槍法樣本（20M至150M條reads），均未檢測到相同的突變，但在reads數(shù)超過200M的8個原始鳥槍法樣本中，有兩個檢測到了相同的突變。我們觀察到，在UPIP樣本中，該位置的平均深度為每百萬總reads占85條reads，而鳥槍法樣本中的讀取深度為0.02，這表明，UPIP檢測法在較低總測序深度下能夠更好地檢出廢水樣本中與耐藥性相關(guān)的變異（圖4）。
檢測重點病原體和潛在的AMR
UPIP靶向的170多種泌尿生殖系統(tǒng)病原體中報告了CDC9觀察列表中的12種病原體（表1）。我們利用Explify應(yīng)用程序的自動化微生物和AMR標(biāo)志物檢測結(jié)果，檢查了與CDC重點威脅相關(guān)的病原體和AMR標(biāo)志物的共同檢測情況。我們發(fā)現(xiàn)，UPIP靶向的12種病原體中，有6種至少在一份樣本中能夠使用潛在的AMR標(biāo)志物檢測出來（圖5）。在UPIP富集樣本中（總reads至少為10M），均能檢測到這12種病原體。在鳥槍法文庫中檢測到了腸球菌屬（Enterococcus）、不動桿菌屬（Acinetobacter）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa），后兩種僅在總reads至少為100M的文庫中檢測到。在UPIP樣本中，所有測序深度均檢測到潛在的AMR標(biāo)志物。值得注意的是，僅在UPIP富集樣本中檢測到抗萬古霉素（例如vanA、vanB、vanC、vanD、vanRA、vanHA、vanYA）和抗甲氧西林（例如mecA、mecR1、mecI）的AMR標(biāo)志物。在本分析中，潛在的AMR標(biāo)志物是指與給定病原體具有已知關(guān)聯(lián)的標(biāo)志物或標(biāo)志物組合。
結(jié)論
使用UPIP探針富集的廢水樣本，可以使靶向AMR標(biāo)志物序列的reads數(shù)量增加 > 2500倍，靶向AMR標(biāo)志物序列的reads深度增加 > 3500倍，每個樣本的AMR標(biāo)志物檢測量增加 > 3倍，并且能夠更可靠地同時檢測CDC重點病原體和潛在AMR標(biāo)志物。顯著提高AMR檢測效率可支持開展更廣泛、更準(zhǔn)確的AMR標(biāo)志物檢測，特別是廢水等復(fù)雜樣本類型中的低豐度AMR標(biāo)志物和AMR標(biāo)志物變異，而成本則大大低于傳統(tǒng)鳥槍法宏基因組學(xué)測序的總成本。這項研究證實了精確宏基因組學(xué)（PMG）適用于優(yōu)先考慮靈敏度和特異性的應(yīng)用，并且UPIP檢測法與Explify UPIP數(shù)據(jù)分析應(yīng)用程序相結(jié)合為環(huán)境AMR監(jiān)測提供了高效的分析解決方案。
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