電轉(zhuǎn)化儀在電穿孔介導(dǎo)的家畜受精卵基因編輯的應(yīng)用

01
電穿孔介導(dǎo)的受精卵基因編輯

如今，將基因編輯物質(zhì)遞送至牲畜受精卵的普遍方法是顯微注射技術(shù)(microinjection ，MI)。這種方法需要昂貴的設(shè)備和較高能力要求的技術(shù)人員，通過人工一個(gè)一個(gè)給受精卵注射基因編輯物質(zhì)，可以對(duì)單個(gè)受精卵進(jìn)行特異性的操作，但過程費(fèi)時(shí)費(fèi)力。且容易導(dǎo)致顯微注射與受精的時(shí)間間隔差異較大，同時(shí)由于過分依賴操作者，可能會(huì)給基因編輯實(shí)驗(yàn)引入不必要的變量。
電穿孔技術(shù)提供了一種將基因編輯物質(zhì)傳遞的新方法。現(xiàn)今大量實(shí)驗(yàn)中會(huì)使用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的細(xì)胞，同時(shí)電穿孔技術(shù)也被應(yīng)用于有效地將基因編輯物質(zhì)傳遞到小鼠和大鼠的受精卵中。
電穿孔技術(shù)需要的設(shè)備僅為電穿孔儀和適宜的電極，將受精卵置于電極杯中或載玻片電極上，懸浮在含有基因編輯試劑的培養(yǎng)基中，電穿孔儀通過電極引導(dǎo)電流脈沖通過受精卵，在受精卵的透明帶和質(zhì)膜上產(chǎn)生暫時(shí)性的微孔，從而使基因編輯試劑通過微孔進(jìn)入受精卵中，進(jìn)而發(fā)揮作用。利用電穿孔的方式可以一次性處理35-100個(gè)受精卵，與顯微注射技術(shù)相比，電穿孔介導(dǎo)的基因編輯試劑的遞送效率大大增高。

 

02
哺乳動(dòng)物受精卵電穿孔條件及優(yōu)化

由于電穿孔技術(shù)操作簡單且效率高，它將成為在家畜物種中實(shí)現(xiàn)高通量基因編輯的重要技術(shù)支撐。然而，為了獲得高存活率和高效基因編輯受精卵，我們需要對(duì)電穿孔參數(shù)進(jìn)行物種特異性的優(yōu)化，并且有針對(duì)性的進(jìn)行應(yīng)用。
過往的研究表明，更高的穿孔電壓、更長的脈沖時(shí)間和更高的 Cas9/sgRNA 濃度都可以使基因編輯效率提高，但會(huì)使受精卵的活力降低。在優(yōu)化電穿孔條件時(shí)，需要在基因編輯效率和受精卵活力之間尋找平衡。不同電穿孔實(shí)驗(yàn)中的最有效參數(shù)高度依賴于受精卵的種類、具體基因編輯類型（敲除或敲入）以及靶基因，因此，在不同實(shí)驗(yàn)中有必要優(yōu)化電轉(zhuǎn)條件中的相關(guān)參數(shù)，從而最有效地獲得基因編輯過的動(dòng)物。

03
應(yīng)用實(shí)例

實(shí)例：使用BEX的CUY21EDIT II 電穿孔儀，通過將 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)電穿孔到受精卵中，高效生成胰島素( INS )基因突變豬

日本德島大學(xué)生物科學(xué)與生物工業(yè)學(xué)院2023 年 1月發(fā)表的《Pigs with an INS point mutation derived from zygotes electroporated with CRISPR/Cas9 and ssODN》研究中，開發(fā)了一種使用 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)通過電穿孔將點(diǎn)突變引入豬受精卵中以生成胰島素基因突變豬，從而為胰島異種移植提供合適的供體。

豬的解剖學(xué)特性和生理學(xué)特性與人類非常相似，所以轉(zhuǎn)基因豬有望成為理想異種移植器官的供體。正因如此，為了保護(hù)豬胰島免受宿主免疫系統(tǒng)的影響，對(duì)胰島微囊化和基因修飾的研究也正在展開開展。豬胰島素與人胰島素的區(qū)別在于B鏈羧基末端的一個(gè)氨基酸(豬的丙氨酸和人的蘇氨酸)。將豬胰島素(INS)基因給定位置上的一個(gè)單核苷酸轉(zhuǎn)換(引入點(diǎn)突變)，使密碼子54的G變成A (GCC，編碼丙氨酸；ACC，編碼蘇氨酸)，從而可以將豬的胰島素轉(zhuǎn)化為人的胰島素，使基因工程豬能產(chǎn)生并分泌人胰島素，從而建立胰島異種移植的適宜供體。

在豬中，點(diǎn)突變要么通過基因編輯器和 ssODN 顯微注射到受精卵/胚胎中，要么通過使用基因編輯體細(xì)胞的體細(xì)胞核移植 (SCNT) 技術(shù)引入。然而，目前還沒有關(guān)于通過電穿孔產(chǎn)生點(diǎn)突變豬的相關(guān)文章。本研究中使用GEEP（gene editing by electroporation of Cas9 protein）方法優(yōu)化了 HDR 介導(dǎo)的將精確點(diǎn)突變引入豬受精卵INS靶區(qū)，并生成了具有INS點(diǎn)突變的豬。

其中，GEEP的電穿孔操作為：將豬受精卵被放置在無核酸酶雙工緩沖液(含有100 ng/μl靶向豬INS基因的gRNA、100 ng/μl Cas9蛋白和16 pmol/μl ssODN)中，置于電極（LF501PT1-20；BEX）間隙中并排成一條線。此后，使用 CUY21EDIT II 電轉(zhuǎn)儀 (BEX) 對(duì)受精卵進(jìn)行電穿孔（25 V 的五個(gè) 1 毫秒脈沖）。電穿孔后，受精卵在PZM-5中培養(yǎng)12小時(shí)直至胚胎移植；或在PZM-5中培養(yǎng)3天，然后在豬囊胚培養(yǎng)基中培養(yǎng)4天，以檢測(cè)囊胚的基因型以及受精卵的發(fā)育能力。

將帶有 1 μM Scr7 的 40-bp 同源的 gRNA、Cas9 蛋白和 ssODN 電穿孔到受精卵中，使用深度測(cè)序分析所得轉(zhuǎn)基因囊胚的基因型以評(píng)估嵌合性，如圖1。13個(gè)囊胚中的4個(gè)攜帶鑲嵌突變，包括所需的點(diǎn)突變等位基因。13個(gè)囊胚中的2個(gè)以雙等位基因方式攜帶所需的點(diǎn)突變。

圖 1 對(duì)囊胚中的INS靶區(qū)進(jìn)行深度測(cè)序分析。gRNA 的目標(biāo)序列和 PAM 序列分別以藍(lán)色和紅色表示。插入和修改的序列分別用綠色和粉色表示。

之后將帶有 1 μM Scr7 的 40-bp 同源的 gRNA、Cas9 蛋白和 ssODN 電穿孔到受精卵中，然后將它們轉(zhuǎn)移到兩個(gè)受體母豬的輸卵管中。一個(gè)受體母豬的每個(gè)輸卵管被移植了100個(gè)胚胎，兩只母豬都懷孕了，并生下了5只小豬。在耳活檢中對(duì)INS基因區(qū)域的目標(biāo)位點(diǎn)進(jìn)行的深度測(cè)序分析表明，所有幼豬都攜帶INS突變，如圖2。 圖 2 仔豬耳部活檢INS靶區(qū)的深度測(cè)序分析。gRNA 的目標(biāo)序列和 PAM 序列分別以藍(lán)色和紅色表示。插入和修改的序列分別用綠色和粉紅色表示。

本研究開發(fā)了一種通過將 CRISPR/Cas9 系統(tǒng)電穿孔到受精卵中來生成具有所需點(diǎn)突變轉(zhuǎn)基因豬的新方法，避免了耗時(shí)且復(fù)雜的顯微操作。通過基因編輯形成的點(diǎn)突變成功地遺傳給了下一代F1，通過將電穿孔介導(dǎo)的點(diǎn)突變引入受精卵成功地建立了用于豬到人異種移植的胰島供體。然而本研究中，引入點(diǎn)突變的效率仍然較低，在未來豬受精卵和胚胎中對(duì)HDR 介導(dǎo)的基因修飾的實(shí)際操作方法仍需要更多的優(yōu)化。

04
總結(jié)

受精卵基因編輯技術(shù)現(xiàn)今被用于以多種方式提高相關(guān)產(chǎn)業(yè)的牲畜生產(chǎn)力和經(jīng)濟(jì)效益。電穿孔可以簡化產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因模式動(dòng)物與轉(zhuǎn)基因牲畜的過程，并使缺乏顯微注射技術(shù)條件的實(shí)驗(yàn)室將基因編輯試劑快速傳遞到哺乳動(dòng)物的受精卵中，更便捷地進(jìn)行受精卵基因編輯。但這一技術(shù)仍需要進(jìn)一步探索和優(yōu)化，針對(duì)不同物種和不同靶基因進(jìn)行更多的實(shí)踐操作，從而在家畜中更高效更快捷地進(jìn)行非嵌合基因敲除和靶向基因插入。

產(chǎn)品介紹

日本BEX公司新CUY21EDITII電轉(zhuǎn)化儀可滿足活體、受精卵、貼壁細(xì)胞、懸浮細(xì)胞以及難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高效基因?qū)�入。由成立�?990年的活體轉(zhuǎn)基因技術(shù)及細(xì)胞融合技術(shù)全球領(lǐng)導(dǎo)者——BEX公司推出。采用先進(jìn)的脈沖技術(shù)，支持恒流輸出、動(dòng)態(tài)衰減脈沖和反轉(zhuǎn)脈沖模式，是一款無需專用試劑的全功能多模式活體細(xì)胞轉(zhuǎn)染儀器，目前已廣泛應(yīng)用于全球?qū)嶒?yàn)室。

CUY21EDITIl可應(yīng)用于細(xì)胞和組織的高效轉(zhuǎn)染，尤其適合于原代細(xì)胞、免疫細(xì)胞、干細(xì)胞等難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的高轉(zhuǎn)化率和高存活率轉(zhuǎn)化。同時(shí)，CUY21EDITIl還可應(yīng)用于貼壁細(xì)胞、離體受精卵及活體的基因轉(zhuǎn)染，根據(jù)不同實(shí)驗(yàn)需求選擇相應(yīng)電極進(jìn)行體內(nèi)體外的轉(zhuǎn)染。

參考文獻(xiàn)：

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