MeRIP-seq等從m6A RNA甲基化角度揭示NFATc1對破骨細胞的調(diào)控機制
雙膦酸鹽類藥物是強效骨吸收抑制劑，是治療骨質(zhì)疏松癥、多發(fā)性骨髓瘤、骨轉(zhuǎn)移等疾病的首選藥物。這些藥物通過抑制甲羥戊酸通路和促進破骨細胞凋亡來促進骨吸收。雙膦酸鹽類藥物是治療骨質(zhì)疏松癥和腫瘤相關(guān)骨病的標志性藥物。然而，在幾十年的臨床應用中，雙膦酸鹽類藥物已經(jīng)引起了嚴重的副作用。
m6A甲基化在骨代謝疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，未來針對m6A甲基化的分子靶向治療將補充甚至替代傳統(tǒng)藥物治療。那RNA甲基化是否參與雙膦酸鹽抑制破骨細胞過程呢？
2023年11月13日，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院Jiang Li、Wei Wang，上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院Wen-jia Wei，和南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院Ping Zhang團隊合作在《Cell Death & Disease volume》雜志發(fā)表題為“ Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption”的研究論文，該研究本研究采用MeRIP-Seq、熒光素酶報告基因檢測、meRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對破骨細胞的調(diào)控機制。
標題：Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption（外泌體靶向遞送METTL14可調(diào)節(jié)NFATc1 m6A甲基化水平，以糾正破骨細胞誘導的骨吸收）
時間：2023-11-13
期刊：Cell Death Dis
影響因子：IF 9 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、熒光素酶報告基因?qū)嶒灥?/strong>
研究摘要：
骨質(zhì)疏松癥對公眾健康有著深遠的影響。一線用藥雙膦酸鹽常引起頜骨壞死，同時抑制破骨細胞。因此，開發(fā)有效的治療方法非常重要。本研究結(jié)果表明，以4249A為功能位點的唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)導致的NFATc1 m6A甲基化水平升高與破骨細胞骨吸收能力減少高度相關(guān)。METTL14上游通過甲基化功能位點NFATc1調(diào)控破骨細胞骨吸收。下游的YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調(diào)m6A甲基化水平后對NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用。本研究采用MeRIP- seq、熒光素酶報告基因?qū)嶒�、MeRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對破骨細胞的調(diào)控機制。此外，外泌體上EphA2過表達是靶向遞送METTL14到破骨細胞的有效生物學方法。本研究表明外泌體釋放的METTL14可以通過增加NFATc1的m6A甲基化水平來抑制破骨細胞，幫助絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者保留骨量，避免引發(fā)頜骨壞死，從而成為治療骨質(zhì)疏松的新型生物活性分子。
研究結(jié)果
（1）高通量測序和差異表達基因
經(jīng)RANKL誘導后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進行RNA-seq和m6A-seq檢測。
A-B. 熱圖和火山圖顯示CON組和ZOL組差異表達的mRNA。
C. KEGG分析在和弦圖中可視化。
D. RNA序列數(shù)據(jù)的破骨細胞分化過程中的變化基因集富集分析(GSEA)圖。
E. 兩組mRNA轉(zhuǎn)錄組中m6A富集圖譜。
F. 兩組中主要的共有motif中鑒定出m6A-seq peaks。
G. 在m6A-seq中發(fā)現(xiàn)的CON組和ZOL組之間的m6A peaks和m6A修飾基因數(shù)量。
H. m6A peak分布圖，顯示兩組中m6A peak占總peaks的比例。
I. 維恩圖顯示兩組中654個差異表達和差異m6a甲基化的交集基因(左)。根據(jù)mRNA水平和m6A甲基化水平對差異表達基因進行分類(右)。
J. 氣泡圖顯示通過基因交叉分析獲得的差異表達基因?qū)Ω信d趣的生物過程的富集(圖1I的紅圈)。
（2）ZOL對成骨細胞和破骨細胞的作用
I. 熱圖顯示ZOL刺激后m6A甲基化相關(guān)酶的差異表達。
J. m6A斑點印跡法顯示雙膦酸鹽治療或未治療的絕經(jīng)后婦女的整體m6A水平。
K. ZOL刺激后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測RAW264.7細胞中METTL14的mRNA和蛋白表達水平。數(shù)據(jù)代表三個生物重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著(p < 0.05)。
（3）ZOL或METTL14抑制破骨細胞分化，并增加破骨細胞前體細胞的m6A甲基化水平
（4）NFATc1基因參與METT14抑制破骨細胞分化過程，只有NFATc1 - 9片段表現(xiàn)出高水平m6A甲基化
圖4：METTL14對NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用
ZOL刺激后，將NFATc1轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞并制備用于進一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況；比例尺:200 μm。
B. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
C. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。將si-NFATc1轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
D. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
E. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
F. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
將NFATc1或METTL14按不同分組分別或同時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
G. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
H. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
I. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
J. 在ZOL或METTL14刺激下，根據(jù)線性回歸分析預測NFATc1 mRNA半衰期。
K. ZOL刺激RAW264.7細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測YTHDF1和YTHDF2的mRNA和蛋白表達水平。
將si-YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
L. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
M. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
N. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
O-P. 采用RT-qPCR和western blotting檢測4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
數(shù)據(jù)代表三個生物學重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著 (p < 0.05)。
（5）YTHDF2通過METTL14上調(diào)NFATc1的甲基化水平，從而對NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出負相關(guān)
圖5：YTHDF1和YTHDF2對NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。
將YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，并制備用于進一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
B. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
C. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
D. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
ZOL刺激RAW264.7細胞后，根據(jù)不同分組分別轉(zhuǎn)染YTHDF2、si-YTHDF2或si-METTL14，并制備用于進一步研究。
E. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況；比例尺:200 μm。
F. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
G. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
H. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
將YTHDF1或METTL14按不同分組分別或同時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，并制備用于進一步研究。
I. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況;比例尺:200 μm。
J. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
K. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
L. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
數(shù)據(jù)代表三個生物重復，用平均值±SD表示。不同字母(a和b)表示多個組之間的顯著差異(p < 0.05)。
（6）YTHDF1和YTHDF2在上調(diào)METTL14甲基化水平后對NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用
圖6：EphA2-EphrinA2對接受外泌體的破骨細胞的影響。
A-D．RIP實驗檢測不同條件下NFATc1–9、10片段的富集率。
E. 外泌體的電子顯微圖像。比例尺:100 nm。
F. MC3T3-1細胞分泌的外泌體大小分布。
G. western blot檢測MC3T3-E1細胞裂解物或外泌體中TFIIB、Lamin A/C、HSP70、TSG101和CD63的蛋白水平。
H. 將EphA2轉(zhuǎn)染至ME3T3-E1細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測外泌體中EphA2的mRNA和蛋白表達水平。
I. 外泌體的冷凍透射電子顯微鏡圖像。紅色箭頭表示納米金探針(1.4 nm)與EphA2受體結(jié)合。比例尺:100 nm。
J. MC3T3-E1細胞外泌體進入RAW264.7細胞的免疫熒光圖像。用PKH26標記外泌體，并在有或沒有EphA2情況下過表達。比例尺:50 nm。
K. 熒光顯微鏡和TRAP染色分析顯示注射到骨髓pkh26標記的外泌體。紅框表示外泌體被破骨細胞吸收。比例尺:200 μm、50 μm。
L. 免疫共沉淀(co-IP)分析表明EphA2-EphrinA2和EphrinA2-EphA2的結(jié)合作用。
M. METTL14轉(zhuǎn)染ME3T3-E1細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測外泌體中METTL14的mRNA和蛋白表達水平。
N. 大鼠活體成像分析顯示，Cy5.5標記的外泌體特異性定位于左上頜第一磨牙拔除后的窩內(nèi)。
O. 拔牙8周后，大鼠雙膦酸鹽相關(guān)性頜骨壞死(BRONJ)及兩種外泌體處理組(Exo+METTL14和Exo+EphA2 +METTL14)的代表性圖片。
P. 注射ZOL或外泌體8周后，采用micro-CT觀察各組大鼠骨組織形態(tài)學變化。
數(shù)據(jù)代表三個生物學重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。
（7）外泌體中的METTL14對體內(nèi)骨丟失具有明顯的挽救作用
圖7：METTL14在體內(nèi)的作用
將EphA2或METTL14轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細胞中，并按照不同的組分別或同時從細胞上清液外泌體中收集。
A-B. 外泌體注射8周后，采用micro-CT和H&E染色檢測骨組織形態(tài)學參數(shù)。比例尺:500 nm。
C. BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BMD 五組的直方圖。
D. TRAP染色評估破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
E. 破骨細胞Oc直方圖。TRAP S/BS及積分光密度值在各組間差異顯著。
F-G. 采用Ctsk和MMP9免疫組織化學染色評估破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
H-I. 5組間Ctsk、MMP9積分光密度直方圖。
J-K. 基于MS/BS, MAR和BFR/BS的骨皮質(zhì)動態(tài)組織形態(tài)學測量的代表性圖像。比例尺:100 μm。
L. 小鼠體內(nèi)成像分析顯示，Cy5.5標記的外泌體特異性定位于脛骨骨髓。
數(shù)據(jù)代表6個生物學重復，用平均值±SD表示。不同字母(a、b、c)組間差異顯著(p < 0.05)。
研究小結(jié)：
本研究發(fā)現(xiàn)NFATc1基因m6A甲基化水平與破骨細胞誘導的骨吸收之間存在強相關(guān)性。4249 A是NFATc1基因的m6A甲基化功能位點。在先前的研究也報告了類似的結(jié)論。m6A修飾導致mRNA和lncRNA的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而促進了異質(zhì)核不均一核糖核蛋白C (hnRNP C)的結(jié)合。2577個m6A殘基特異性地破壞了lncRNA MALAT1的發(fā)夾柄（hairpin-stem）穩(wěn)定性，從而增加對向U-tract的可及性或單鏈性，并改善了與hnRNP C的互作。通過m6A依賴性RNA結(jié)構(gòu)重塑來調(diào)控RNA-蛋白質(zhì)互作機制被稱為“m6A開關(guān)（m6A switch）”。m6A功能位點是相關(guān)生物學效應的核心。這個位于NFATc1 4249 A的“m6A開關(guān)”與破骨細胞分化和骨吸收密切相關(guān)。METTL14、YTHDF1或YTHDF2在不同程度上調(diào)控“m6A開關(guān)”節(jié)點。兩個研究結(jié)果表明，與m6A甲基化相關(guān)的破骨細胞骨吸收由同一信號通路(NFκB)中不同的關(guān)鍵分子(上游RANK和下游NFATc1)共同調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)證明了m6A甲基化在破骨細胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，并且每個關(guān)鍵分子的基因上都有m6A甲基化功能位點。這一理論基礎(chǔ)為通過m6A甲基化功能位點精確控制破骨細胞分化治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的思路。
參考文獻：
Yang JG, Sun B, Wang Z, Li X, Gao JH, Qian JJ, Li J, Wei WJ, Zhang P, Wang W. Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption. Cell Death Dis. 2023 Nov 13;14(11):738. pii: 10.1038/s41419-023-06263-4. doi: 10.1038/s41419-023-06263-4. PubMed PMID: 37957146.
m6A甲基化在骨代謝疾病的發(fā)病機制中起著重要作用，未來針對m6A甲基化的分子靶向治療將補充甚至替代傳統(tǒng)藥物治療。那RNA甲基化是否參與雙膦酸鹽抑制破骨細胞過程呢？
2023年11月13日，上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院Jiang Li、Wei Wang，上海交通大學醫(yī)學院附屬同仁醫(yī)院Wen-jia Wei，和南京醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院Ping Zhang團隊合作在《Cell Death & Disease volume》雜志發(fā)表題為“ Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption”的研究論文，該研究本研究采用MeRIP-Seq、熒光素酶報告基因檢測、meRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對破骨細胞的調(diào)控機制。
標題：Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption（外泌體靶向遞送METTL14可調(diào)節(jié)NFATc1 m6A甲基化水平，以糾正破骨細胞誘導的骨吸收）
時間：2023-11-13
期刊：Cell Death Dis
影響因子：IF 9 / 1區(qū)
技術(shù)平臺：MeRIP-seq、RNA-seq、熒光素酶報告基因?qū)嶒灥?/strong>
研究摘要：
骨質(zhì)疏松癥對公眾健康有著深遠的影響。一線用藥雙膦酸鹽常引起頜骨壞死，同時抑制破骨細胞。因此，開發(fā)有效的治療方法非常重要。本研究結(jié)果表明，以4249A為功能位點的唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)導致的NFATc1 m6A甲基化水平升高與破骨細胞骨吸收能力減少高度相關(guān)。METTL14上游通過甲基化功能位點NFATc1調(diào)控破骨細胞骨吸收。下游的YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調(diào)m6A甲基化水平后對NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用。本研究采用MeRIP- seq、熒光素酶報告基因?qū)嶒�、MeRIP等方法從RNA甲基化角度闡明NFATc1對破骨細胞的調(diào)控機制。此外，外泌體上EphA2過表達是靶向遞送METTL14到破骨細胞的有效生物學方法。本研究表明外泌體釋放的METTL14可以通過增加NFATc1的m6A甲基化水平來抑制破骨細胞，幫助絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者保留骨量，避免引發(fā)頜骨壞死，從而成為治療骨質(zhì)疏松的新型生物活性分子。
本研究示意圖
ZOL導致NFATc1 m6A甲基化水平增加，其中4249bp A為功能位點，與破骨細胞骨吸收功能下降高度相關(guān)。上游，METTL14通過甲基化功能位點NFATc1調(diào)控破骨細胞骨吸收。下游，YTHDF1和YTHDF2在METTL14上調(diào)m6A甲基化水平后對NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用。研究結(jié)果
（1）高通量測序和差異表達基因
經(jīng)RANKL誘導后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進行RNA-seq和m6A-seq檢測。
圖1：高通量測序和差異表達基因
經(jīng)RANKL誘導后，在有或沒有ZOL (5 μM)刺激下分別收集RAW264.7細胞樣本。提取兩組樣本的總RNA進行RNA-seq和m6A-seq檢測。A-B. 熱圖和火山圖顯示CON組和ZOL組差異表達的mRNA。
C. KEGG分析在和弦圖中可視化。
D. RNA序列數(shù)據(jù)的破骨細胞分化過程中的變化基因集富集分析(GSEA)圖。
E. 兩組mRNA轉(zhuǎn)錄組中m6A富集圖譜。
F. 兩組中主要的共有motif中鑒定出m6A-seq peaks。
G. 在m6A-seq中發(fā)現(xiàn)的CON組和ZOL組之間的m6A peaks和m6A修飾基因數(shù)量。
H. m6A peak分布圖，顯示兩組中m6A peak占總peaks的比例。
I. 維恩圖顯示兩組中654個差異表達和差異m6a甲基化的交集基因(左)。根據(jù)mRNA水平和m6A甲基化水平對差異表達基因進行分類(右)。
J. 氣泡圖顯示通過基因交叉分析獲得的差異表達基因?qū)Ω信d趣的生物過程的富集(圖1I的紅圈)。
（2）ZOL對成骨細胞和破骨細胞的作用
圖2：ZOL對成骨細胞和破骨細胞的作用
- 不同濃度的ZOL，成骨誘導21d或7d后對MC3T3-E1細胞和BMSCs進行茜素紅S（Alizarin Red S,ARS）或ALP（Alkaline phosphatase）染色。
- 不同濃度ZOL作用下MC3T3-E1細胞和BMSCs中ALP、Bglap、Col1α1和Runx2的相對表達水平。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測不同濃度ZOL作用下破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm。
- 不同濃度ZOL作用下TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核的直方圖。
- 不同濃度ZOL作用下RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
- western blot檢測不同濃度ZOL作用下RAW264.7細胞中c-fos、NFATc1、RANK和NFκB p-P65蛋白的表達水平。
I. 熱圖顯示ZOL刺激后m6A甲基化相關(guān)酶的差異表達。
J. m6A斑點印跡法顯示雙膦酸鹽治療或未治療的絕經(jīng)后婦女的整體m6A水平。
K. ZOL刺激后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測RAW264.7細胞中METTL14的mRNA和蛋白表達水平。數(shù)據(jù)代表三個生物重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著(p < 0.05)。
（3）ZOL或METTL14抑制破骨細胞分化，并增加破骨細胞前體細胞的m6A甲基化水平
圖3：NFATc1–9片段對METT14調(diào)節(jié)破骨細胞分化過程的作用。
首先，將METTL14轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞并制備用于進一步研究。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
- 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
- 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
- TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
- 兩組trap陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
- 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
- ZOL刺激后破骨細胞分化差異表達基因的熱圖。
- KEGG分析揭示了三個交集的差異表達基因：破骨細胞分化基因，MeRIP高表達基因和mRNA下調(diào)基因。
- RT-qPCR分析顯示ZOL刺激或METTL14過表達后10個差異表達基因的表達水平。
- NFATc1的基因組位點示意圖。
- 在ZOL刺激或未刺激下，NFATc1轉(zhuǎn)錄本中meRIP-Seq的m6A peaks可視化。m6A peaks位于NFATc1的3‘UTR區(qū)。
- SRAMP網(wǎng)站上NFATc1潛在的m6A甲基化位點。
- 根據(jù)潛在的m6A甲基化位點將NFATc1分為9個片段。
- m6A-RT-qPCR檢測ZOL刺激后抗m6A組和抗IgG組之間NFATc1的9個片段富集情況。
- m6A-RT-qPCR檢測NFATc1–9、10片段隨著ZOL濃度的增加而富集。
- m6A-RT-qPCR檢測ZOL或si-METTL14刺激下NFATc1–9、10片段的富集情況。
（4）NFATc1基因參與METT14抑制破骨細胞分化過程，只有NFATc1 - 9片段表現(xiàn)出高水平m6A甲基化
圖4：METTL14對NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用ZOL刺激后，將NFATc1轉(zhuǎn)染至RAW264.7細胞并制備用于進一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況；比例尺:200 μm。
B. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
C. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。將si-NFATc1轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
D. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
E. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
F. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
將NFATc1或METTL14按不同分組分別或同時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
G. TRAP染色和F-actin帶染色檢測兩組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
H. 兩組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率、細胞核直方圖。
I. 兩組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
J. 在ZOL或METTL14刺激下，根據(jù)線性回歸分析預測NFATc1 mRNA半衰期。
K. ZOL刺激RAW264.7細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測YTHDF1和YTHDF2的mRNA和蛋白表達水平。
將si-YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，制備用于進一步研究。
L. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
M. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
N. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
O-P. 采用RT-qPCR和western blotting檢測4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
數(shù)據(jù)代表三個生物學重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。不同字母(a、b、c、d、e)組間差異顯著 (p < 0.05)。
（5）YTHDF2通過METTL14上調(diào)NFATc1的甲基化水平，從而對NFATc1的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出負相關(guān)
圖5：YTHDF1和YTHDF2對NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用。將YTHDF2或METTL14按不同分組分別或同時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，并制備用于進一步研究。
A. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況。比例尺:200 μm。
B. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
C. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
D. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
ZOL刺激RAW264.7細胞后，根據(jù)不同分組分別轉(zhuǎn)染YTHDF2、si-YTHDF2或si-METTL14，并制備用于進一步研究。
E. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況；比例尺:200 μm。
F. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
G. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
H. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
將YTHDF1或METTL14按不同分組分別或同時轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞，并制備用于進一步研究。
I. TRAP染色和F-actin帶染色檢測4組破骨細胞分化情況;比例尺:200 μm。
J. 4組TRAP陽性破骨細胞數(shù)量、覆蓋率及細胞核直方圖。
K. 4組RAW264.7細胞中Ctsk、MMP9和Acp5的相對表達水平。
L. 分別采用RT-qPCR和western blot分析4組RAW264.7細胞中NFATc1的mRNA和蛋白表達水平。
數(shù)據(jù)代表三個生物重復，用平均值±SD表示。不同字母(a和b)表示多個組之間的顯著差異(p < 0.05)。
（6）YTHDF1和YTHDF2在上調(diào)METTL14甲基化水平后對NFATc1轉(zhuǎn)錄后調(diào)控表現(xiàn)出拮抗作用
圖6：EphA2-EphrinA2對接受外泌體的破骨細胞的影響。A-D．RIP實驗檢測不同條件下NFATc1–9、10片段的富集率。
E. 外泌體的電子顯微圖像。比例尺:100 nm。
F. MC3T3-1細胞分泌的外泌體大小分布。
G. western blot檢測MC3T3-E1細胞裂解物或外泌體中TFIIB、Lamin A/C、HSP70、TSG101和CD63的蛋白水平。
H. 將EphA2轉(zhuǎn)染至ME3T3-E1細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測外泌體中EphA2的mRNA和蛋白表達水平。
I. 外泌體的冷凍透射電子顯微鏡圖像。紅色箭頭表示納米金探針(1.4 nm)與EphA2受體結(jié)合。比例尺:100 nm。
J. MC3T3-E1細胞外泌體進入RAW264.7細胞的免疫熒光圖像。用PKH26標記外泌體，并在有或沒有EphA2情況下過表達。比例尺:50 nm。
K. 熒光顯微鏡和TRAP染色分析顯示注射到骨髓pkh26標記的外泌體。紅框表示外泌體被破骨細胞吸收。比例尺:200 μm、50 μm。
L. 免疫共沉淀(co-IP)分析表明EphA2-EphrinA2和EphrinA2-EphA2的結(jié)合作用。
M. METTL14轉(zhuǎn)染ME3T3-E1細胞后，分別采用RT-qPCR和western blot檢測外泌體中METTL14的mRNA和蛋白表達水平。
N. 大鼠活體成像分析顯示，Cy5.5標記的外泌體特異性定位于左上頜第一磨牙拔除后的窩內(nèi)。
O. 拔牙8周后，大鼠雙膦酸鹽相關(guān)性頜骨壞死(BRONJ)及兩種外泌體處理組(Exo+METTL14和Exo+EphA2 +METTL14)的代表性圖片。
P. 注射ZOL或外泌體8周后，采用micro-CT觀察各組大鼠骨組織形態(tài)學變化。
數(shù)據(jù)代表三個生物學重復，用平均值±SD表示(*p < 0.05)。
（7）外泌體中的METTL14對體內(nèi)骨丟失具有明顯的挽救作用
圖7：METTL14在體內(nèi)的作用將EphA2或METTL14轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細胞中，并按照不同的組分別或同時從細胞上清液外泌體中收集。
A-B. 外泌體注射8周后，采用micro-CT和H&E染色檢測骨組織形態(tài)學參數(shù)。比例尺:500 nm。
C. BV/TV、Tb.N、Tb.Th、Tb.Sp和BMD 五組的直方圖。
D. TRAP染色評估破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
E. 破骨細胞Oc直方圖。TRAP S/BS及積分光密度值在各組間差異顯著。
F-G. 采用Ctsk和MMP9免疫組織化學染色評估破骨細胞分化和骨吸收能力。比例尺:200 μm、100 μm。
H-I. 5組間Ctsk、MMP9積分光密度直方圖。
J-K. 基于MS/BS, MAR和BFR/BS的骨皮質(zhì)動態(tài)組織形態(tài)學測量的代表性圖像。比例尺:100 μm。
L. 小鼠體內(nèi)成像分析顯示，Cy5.5標記的外泌體特異性定位于脛骨骨髓。
數(shù)據(jù)代表6個生物學重復，用平均值±SD表示。不同字母(a、b、c)組間差異顯著(p < 0.05)。
研究小結(jié)：
本研究發(fā)現(xiàn)NFATc1基因m6A甲基化水平與破骨細胞誘導的骨吸收之間存在強相關(guān)性。4249 A是NFATc1基因的m6A甲基化功能位點。在先前的研究也報告了類似的結(jié)論。m6A修飾導致mRNA和lncRNA的局部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而促進了異質(zhì)核不均一核糖核蛋白C (hnRNP C)的結(jié)合。2577個m6A殘基特異性地破壞了lncRNA MALAT1的發(fā)夾柄（hairpin-stem）穩(wěn)定性，從而增加對向U-tract的可及性或單鏈性，并改善了與hnRNP C的互作。通過m6A依賴性RNA結(jié)構(gòu)重塑來調(diào)控RNA-蛋白質(zhì)互作機制被稱為“m6A開關(guān)（m6A switch）”。m6A功能位點是相關(guān)生物學效應的核心。這個位于NFATc1 4249 A的“m6A開關(guān)”與破骨細胞分化和骨吸收密切相關(guān)。METTL14、YTHDF1或YTHDF2在不同程度上調(diào)控“m6A開關(guān)”節(jié)點。兩個研究結(jié)果表明，與m6A甲基化相關(guān)的破骨細胞骨吸收由同一信號通路(NFκB)中不同的關(guān)鍵分子(上游RANK和下游NFATc1)共同調(diào)控。這一發(fā)現(xiàn)證明了m6A甲基化在破骨細胞分化過程中起著關(guān)鍵作用，并且每個關(guān)鍵分子的基因上都有m6A甲基化功能位點。這一理論基礎(chǔ)為通過m6A甲基化功能位點精確控制破骨細胞分化治療骨質(zhì)疏松癥提供了新的思路。
參考文獻：
Yang JG, Sun B, Wang Z, Li X, Gao JH, Qian JJ, Li J, Wei WJ, Zhang P, Wang W. Exosome-targeted delivery of METTL14 regulates NFATc1 m6A methylation levels to correct osteoclast-induced bone resorption. Cell Death Dis. 2023 Nov 13;14(11):738. pii: 10.1038/s41419-023-06263-4. doi: 10.1038/s41419-023-06263-4. PubMed PMID: 37957146.
標簽：
RNA甲基化
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