AlbuPure從發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中捕獲純化重組白蛋白融合蛋白的優(yōu)勢

人血清白蛋白(HSA)在生物制藥行業(yè)有著廣泛的應(yīng)用，包括血漿擴(kuò)增、配方賦形劑、藥物輸送、傷口愈合以及作為融合搭檔延長蛋白質(zhì)藥物的半衰期。由于人血清白蛋白的供應(yīng)有限，無法滿足臨床需求，因此科研人員正在尋找其他來源的白蛋白，例如通過基因工程生產(chǎn)重組人血清白蛋白，以及各種各樣的白蛋白融合蛋白已經(jīng)被生產(chǎn)出來，以延長融合蛋白的循環(huán)半衰期，同時保持其活性。

目前，重組白蛋白的生產(chǎn)主要依賴于基因工程方法，通過酵母、CHO細(xì)胞或大腸桿菌等表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)目標(biāo)蛋白，再進(jìn)行分離純化等工藝。然而，在表達(dá)和純化過程中，存在一些技術(shù)難題，如表達(dá)水平低、翻譯后修飾不完全、純化步驟繁瑣且收率低等。
 

為了解決重組白蛋白融合蛋白純化步驟繁瑣且收率低的問題，Astrea Bioseparations與Albumedix【重組白蛋白產(chǎn)品的領(lǐng)先生產(chǎn)商和白蛋白融合蛋白技術(shù)的開發(fā)商(Veltis®)】合作開發(fā)了AlbuPure®，一種高度穩(wěn)定、穩(wěn)健、無毒、具有高結(jié)合能力、高回收率和高純度的親和色譜。符合ISO 9001質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的生產(chǎn)環(huán)境，可用于白蛋白及白蛋白融合蛋白的純化和cGMP生產(chǎn)。

AlbuPure®是一種新型合成三嗪配基，源自Astrea Bioseparations的“Mimetic Ligand™ ”技術(shù)，并與其專利PuraBead®6HF瓊脂糖基質(zhì)偶聯(lián)。該技術(shù)提供了穩(wěn)定的基架和配體，可以使用1 M NaOH進(jìn)行清潔，壽命較長。
 

AlbuPure®捕獲和純化重組白蛋白融合蛋白案例分享：
材料與方法 
使用AlbuPure®在自動色譜工作站上純化Albumedix酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的不同白蛋白融合蛋白IL-1ra和anti-HIV gp41，在上樣前都經(jīng)過預(yù)處理。 

未結(jié)合蛋白和結(jié)合不緊密的蛋白通過平衡緩沖液去除。結(jié)合的非靶標(biāo)蛋白隨后使用一系列增加pH的緩沖液洗脫。白蛋白融合蛋白使用含有辛酸鈉的緩沖液選擇性地洗脫。
 

表1:使用AlbuPure®從CCS中捕獲純化IL-1ra和anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白并去除宿主細(xì)胞蛋白(HCP)的色譜條件。 

*白蛋白融合蛋白-基因融合: 
(1) IL-1ra  - 18 kDa(大分子量) 
(2) gp41    - 5 kDa(小分子量) 
用稀乙酸調(diào)節(jié)得到pH為5.3的樣品，電導(dǎo)率為~ 3mS /cm。 

結(jié)果與討論 
一、IL-1ra白蛋白融合蛋白 
IL-1ra 白蛋白融合蛋白 （~85 kDa） 被 AlbuPure® 吸附劑捕獲，非靶標(biāo)蛋白在色譜柱中流穿。使用一系列pH值增加的緩沖液洗滌去除宿主細(xì)胞蛋白，之后使用含有辛酸鈉的緩沖液選擇性地從柱中洗脫白蛋白融合蛋白(圖1)。通過SDS-PAGE分析工藝餾分(圖2)。

圖1:利用AlbuPure®從CCS中捕獲和純化IL-1ra白蛋白融合蛋白、去除HCP的色譜圖。

圖 2: 使用 AlbuPure® 純化的 CCS 中 IL-1ra 白蛋白融合蛋白層析組分的SDS-PAGE. Lane 1: Load (diluted); Lane 2: FT (neat); Lane 3: post load wash (neat); Lane 4: wash 1 (neat); Lane 5: wash 2 (neat); Lane 6: wash 3 (neat); Lane 7: elution (diluted); Lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); Lane 9: human albumin standard (1 µg).

SDS-PAGE 分析（圖 2）表明目標(biāo)蛋白較高的結(jié)合能力，非目標(biāo)蛋白在流穿液和洗滌液中（lanes 2 and 3）。增加 pH 值的洗滌步驟（lanes 4 to 6）突出表明非目標(biāo)蛋白大量被清除（只有少量目標(biāo)蛋白流失）。洗脫部分顯示出較高的IL-1ra 白蛋白融合蛋白的純度和回收率（lanes 7 and 8）。

二、anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白 
使用 AlbuPure® 捕獲并純化anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白（~72 kDa）,非靶標(biāo)蛋白在色譜柱中流穿。使用一系列pH值增加的緩沖液洗滌去除宿主細(xì)胞蛋白(HCP)。gp41白蛋白融合蛋白選擇性用辛酸鈉從柱中洗脫（圖3）;過程餾分通過SDS-PAGE進(jìn)行分析（圖 4）。  

圖3:使用AlbuPure®從CCS中捕獲和純化anti-HIV gp41白蛋白融合蛋白的色譜圖

SDS-PAGE分析(圖4)表明目標(biāo)蛋白較高的結(jié)合能力，非目標(biāo)蛋白在流穿液和洗滌液中(lanes 2 and 3)。增加 pH 值的洗滌步驟（lanes 4 to 6）突出表明非目標(biāo)蛋白大量被清除（只有少量目標(biāo)蛋白流失）。洗脫部分顯示出較高的anti-HIVgp41白蛋白融合蛋白的純度和回收率（lanes 7 and 8）。

圖 4: 使用 AlbuPure® 純化的 CCS 中anti-HIVgp41白蛋白融合蛋白層析組分的 SDS-PAGE。 Lane: 1. Load (diluted); Lane 2: FT (neat); Lane 3: post load wash (neat); Lane 4: wash 1 (neat); Lane 5: wash 2 (neat); Lane 6: wash 3 (neat); Lane 7: elution (diluted); Lane 8: elution (10 fold dilution of lane 7); Lane 9: human albumin standard (1 µg)

總結(jié)
AlbuPure®可用于從發(fā)酵和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中捕獲和純化重組白蛋白融合蛋白，如本案例所示，具有高純度和回收率。   

AlbuPure®吸附劑已被用于純化各種分子量的白蛋白融合蛋白：

此外，AlbuPure®能夠以高達(dá)600厘米/小時的流速處理復(fù)雜的原料。因此，AlbuPure吸附劑可以通過縮短處理時間來顯著降低制造成本，它具有高操作流速和高結(jié)合能力，以及重復(fù)再生使用的性能。 
 

參考資料 
Data courtesy of Albumedix Ltd: Use of a Novel Affinity Matrix as a Platform Purification for Albumin Fusions, Recovery of Biological Products XIV Conference presentation, Lake Tahoe, California, August 1st – 6th 2010.