NetMHCIIpan4.3準(zhǔn)確預(yù)測HLA-Il類抗原在所有基因座呈遞詳解

瀏覽次數(shù)：1437　發(fā)布日期：2023-12-1　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

背景介紹

主要組織相容性復(fù)合體(MHC)II類分子，也被稱為人類白細(xì)胞抗原(HLA)II類分子，在特異性抗原呈遞細(xì)胞表面表達(dá)，通過向CD4+T細(xì)胞呈遞抗原肽，在免疫系統(tǒng)功能中起關(guān)鍵作用^[1,2]。從結(jié)構(gòu)上看，這些分子是由三個(gè)不同的基因座(HLA-DR, HLA-DP, HLA-DQ)編碼的，并由α鏈和β鏈組成的異源二聚體，是人類基因組中多態(tài)性最高的基因之一^[3]。這些多態(tài)性大多聚集在由α和β鏈形成的肽結(jié)合區(qū)域周圍，從而產(chǎn)生廣泛的肽結(jié)合特異性。HLA研究中，模擬免疫反應(yīng)激活的過程，就要經(jīng)過蛋白酶體對抗原（蛋白）的剪切預(yù)測、肽段轉(zhuǎn)運(yùn)、肽段和MHC-I結(jié)合親和力預(yù)測以及T細(xì)胞識別預(yù)測等幾個(gè)重要步驟。準(zhǔn)確預(yù)測人類白細(xì)胞抗原(HLA)II類分子的抗原呈遞對于合理開發(fā)針對CD4+T細(xì)胞活化的免疫療法和疫苗至關(guān)重要。

2023年11月24日，Science Advances（IF=13.6）發(fā)表了NetMHCIIpan的最新算法文章“Accurate prediction of HLA class II antigen presentation across all loci using tailored data acquisition and refined machine learning”。作者將覆蓋所有三個(gè)基因座的大規(guī)模高質(zhì)量免疫肽組學(xué)數(shù)據(jù)集整合到NetMHCIIpan機(jī)器學(xué)習(xí)框架中，并應(yīng)用最新版本的NNAlign_MA方法，將正向與反向的肽結(jié)合模式（正向結(jié)合從N端到C端，反向?yàn)镃端到N端方向結(jié)合）預(yù)測納入方法訓(xùn)練模型，從而縮小DR和DQ/DP之間的差距。利用這種方法，研究了HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP的預(yù)測性能，以及反向結(jié)合模式的預(yù)測如何影響基序解卷積，擴(kuò)大了HLA覆蓋范圍。最終，NetMHCIIpan-4.3在所有HLA II類同種異型抗原中實(shí)現(xiàn)了高精度和分子覆蓋率。其中，免疫肽組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的分析使用PEAKS Studio 11完成。

使用到的免疫肽組學(xué)數(shù)據(jù)集概覽

作者整合了在NetMHCIIpan-4.2模型訓(xùn)練中使用到的免疫肽組學(xué)數(shù)據(jù)集，從圖1A可以看出大多數(shù)訓(xùn)練集的數(shù)據(jù)來自于MA（multi-allelic）組學(xué)數(shù)據(jù)。圖1B顯示了每個(gè)基因座的SA（single-allelic）和MA數(shù)據(jù)集數(shù)量，表明Balen_DP^[4-6]數(shù)據(jù)的引入使得HLA-DP具有與HLA-DR相似數(shù)量的SA數(shù)據(jù)集，HLA-DQ的SA數(shù)據(jù)較少。圖1C和D展示了兩個(gè)樣本在HLA基序解卷積中分配給DR、DP和DQ的肽的比例，其中一個(gè)樣本使用傳統(tǒng)的兩步免疫沉淀方案處理（即先后使用泛DR抗體和泛II類抗體處理），第二個(gè)樣本使用單獨(dú)的DR、DQ和DP位點(diǎn)特異性抗體處理。圖1C顯示泛II類抗體的DP和DQ特異性較差，導(dǎo)致這兩個(gè)位點(diǎn)的肽產(chǎn)量非常低。相反，圖1D展示了應(yīng)用三種位點(diǎn)特異性抗體產(chǎn)生的高特異肽。

圖1 數(shù)據(jù)集概覽

DP數(shù)據(jù)和反向結(jié)合模式對于預(yù)測性能的影響

基于上述數(shù)據(jù)集，大幅提高了DP和DQ肽的產(chǎn)量，然后使用NNAlign_MA框架訓(xùn)練HLA抗原呈遞的預(yù)測模型^[7]。在模型訓(xùn)練之前，對質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，并用隨機(jī)生成的天然陰性對照肽進(jìn)行富集。同時(shí)預(yù)測結(jié)合核心偏移和肽配體的正向與反向結(jié)合。然后，訓(xùn)練了三個(gè)初始預(yù)測模型來評估Balen_DP數(shù)據(jù)的影響:一個(gè)不包含Balen數(shù)據(jù)和沒有反向肽結(jié)合(wo_Balen_DP)，一個(gè)包含Balen數(shù)據(jù)和沒有反向肽結(jié)合(w_Balen_DP)，一個(gè)包含Balen數(shù)據(jù)和使用反向肽結(jié)合 (w_inversion)。最后，使用每個(gè)分子和每個(gè)樣品的交叉驗(yàn)證對這些方法進(jìn)行評估。

通過AUC（area under ROC curve）、AUC0.1（FDR為10%時(shí)的area under ROC curve）和PPV（positive predictive value）三個(gè)指標(biāo)來評估預(yù)測性能。圖2A表明Balen_DP數(shù)據(jù)中包含的信息對該方法學(xué)習(xí)其他基因座的特異性的影響有限，而對DP的預(yù)測都有顯著的性能提高。圖2B進(jìn)一步表明，包含肽反向結(jié)合的模型也會顯著改善DP的預(yù)測性能。并且，在所有注釋的163604個(gè)DP肽中，有78%（127190條）的DP肽是三個(gè)模型共同注釋到（圖2C），表明這些方法模型對DP配體的高度識別。

圖2 HLA-DP預(yù)測性能評估

反轉(zhuǎn)結(jié)合基序

圖3A顯示了反向肽在HLA分子中不同位點(diǎn)的百分比分布。由此，發(fā)現(xiàn)肽反轉(zhuǎn)幾乎只發(fā)生在HLA-DP上。當(dāng)觀察每個(gè)DP分子的反轉(zhuǎn)百分比時(shí)(圖3B)，看到含有5%以上肽反轉(zhuǎn)的分子都具有DPA1*02:01或DPA1*02:02的α鏈。此外，小于5%肽反轉(zhuǎn)的分子都具有相同的DPA1*01:03 α鏈。這表明，HLA-DP α鏈?zhǔn)欠聪螂慕Y(jié)合模式的主要決定因素。這些觀察結(jié)果與近期的一些研究趨勢一致，但作者的方法比先前研究更多地預(yù)測到了DPB1*03:01反向肽。另外，圖3C展示了經(jīng)過和沒有經(jīng)過反轉(zhuǎn)訓(xùn)練模型的DPA1*02:02-DPB1*05:01和DPA1*02:02-DPB1*19:01的基序，對于沒有反轉(zhuǎn)的方法，識別出的基序是圍繞中心位置鏡像分布的，K和R同時(shí)存在于P1和P9。相反，對于反轉(zhuǎn)訓(xùn)練的模型，由于考慮了雙重結(jié)合模式，使得基序更加清晰，K和R偏好僅在P1處存在。進(jìn)一步證明了納入反向肽的模型后對DP基序解卷積的改善。

圖3肽反轉(zhuǎn)模型使得DP基序解卷積更準(zhǔn)確

解卷積結(jié)果與預(yù)測基序的關(guān)聯(lián)度

接下來，作者研究了Balen_DP數(shù)據(jù)中的19個(gè)HLA-DP分子，通過比較解卷積獲得的結(jié)合基序與基于隨機(jī)天然肽的預(yù)測基序之間的相關(guān)性，評估該訓(xùn)練模型對MS數(shù)據(jù)中結(jié)合基序的學(xué)習(xí)能力。圖4A展示了DPA1*02:01-DPB1*01:01的數(shù)據(jù)，在不同的訓(xùn)練模型中得出的解卷積基序總體上一致。但是從預(yù)測的結(jié)果上看，不使用Balen_DP數(shù)據(jù)的模型無法完全學(xué)習(xí)正確的基序。此外，反轉(zhuǎn)方法無論是在預(yù)測，還是解卷積到的基序，一致性都很高，可以將“K”定位在P1而不是P9。

然后，基于Balen_DP數(shù)據(jù)中所有樣本的交叉驗(yàn)證預(yù)測和上述得分最高的隨機(jī)天然肽，為Balen_DP數(shù)據(jù)中的每個(gè)分子構(gòu)建了位置特異性頻率矩陣(PSFMs)。這個(gè)KLD度量可以解釋為兩個(gè)分子結(jié)合基序之間的“距離”，其中較低的值表明更多相似的基序。分析結(jié)果如圖4B所示，包含反轉(zhuǎn)方法的模型KLD值顯著低于未包含反轉(zhuǎn)的方法。另外觀察到，在大多數(shù)情況下，具有相同β鏈的分子對具有相似的基序，這表明β鏈?zhǔn)荄P分子的主要特異性定義元件。

圖4 觀察到的和預(yù)測到的基序之間的對應(yīng)關(guān)系

HLA-DP分子覆蓋率

經(jīng)過前面的工作，基本驗(yàn)證了該方法對HLA II類抗原較好的預(yù)測能力，接下來作者又對HLA-DP分子的覆蓋范圍做了探究。通過考慮在不超過0.05的距離內(nèi)發(fā)現(xiàn)的DP分子參考集與肽覆蓋分子的比例來估計(jì)功能覆蓋范圍，從分析中發(fā)現(xiàn)包含Balen_DP數(shù)據(jù)的模型功能性DP覆蓋率顯著增加。接下來，使用反轉(zhuǎn)的方法，基于MHCCluster方法構(gòu)建了一個(gè)DP特異性樹^[8]。簡而言之，基于偽序列，167個(gè)流行的DP分子被減少到95個(gè)具有獨(dú)特特異性的分子^[9]。然后，根據(jù)大量隨機(jī)天然肽的預(yù)測分?jǐn)?shù)之間的相關(guān)性估計(jì)分子之間的距離，得到如圖5所示的樹。從特異性樹中觀察到該模型具有不同DP特異性的廣泛覆蓋范圍，大多數(shù)分支至少具有一個(gè)肽覆蓋分子(具有至少50個(gè)可信肽注釋的分子)。然而，一些分支機(jī)構(gòu)被覆蓋率較低。其中一個(gè)分支包括DPA1*02:01DPB1*04:01，該分支的基序沒有通過前面描述的預(yù)測方法正確學(xué)習(xí)。該分子存在于訓(xùn)練數(shù)據(jù)中的7個(gè)樣本中，均為異雜合子。在所有這些樣本中，該分子被分配的DP注釋少于5%，導(dǎo)致有效肽計(jì)數(shù)為0。這種肽注釋的缺乏可能是生物學(xué)上的原因，也可能是由于缺乏高質(zhì)量的分子數(shù)據(jù)而導(dǎo)致該方法沒有充分學(xué)習(xí)到分子的特異性。

在上述分析的基礎(chǔ)上，利用DP特異性免疫沉淀法從表達(dá)DPA1*01:03 - DPB1 *16:01、DPA1*02:01-DPB1*04:01和DPA1*02:02 - dDPB1 *02:02的DP純合子細(xì)胞系中獲得免疫肽組學(xué)質(zhì)譜數(shù)據(jù)。FDR小于1的肽段數(shù)分別為2423、1797和2428。在去除翻譯后修飾和冗余肽后，每個(gè)樣本中獨(dú)特的12- 21-mer肽的數(shù)量分別減少到1550,1259和1502，然后使用反轉(zhuǎn)重新訓(xùn)練的方法，以評估它們對DP基序解卷積和分子覆蓋的影響。

結(jié)果顯示，重新訓(xùn)練的方法能夠從每個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)集中注釋678(53.8%)、715(47.6%)和1062(68.5%)個(gè)百分位等級小于20的多肽，分別指向DPA1*02:01-DPB1*04:01、DPA1*02:02-DPB1*02:02和DPA1*01:03-DPB1*16:01，其基序如圖6A所示。剩余的多肽是主要分配給HLA-DR和HLA-DQ共流出肽段。據(jù)預(yù)測，DPA1*02:02- DPB1 *02:02的反轉(zhuǎn)結(jié)合肽比例很高(25.3%)，而反轉(zhuǎn)肽在P4位點(diǎn)對組氨酸有偏好(圖6B)。此外，比較了DP注釋肽的長度分布，證實(shí)了15-mer肽的正態(tài)分布，這與大多數(shù)HLA I類(包括其他DP分子)的長度偏好一致(圖6C)。將包含和不包含這些數(shù)據(jù)集的模型進(jìn)行比較，正如預(yù)期，具有肽覆蓋的DP分子數(shù)增加了(24到27)，使得167個(gè)DP分子的覆蓋范圍擴(kuò)大到131個(gè)(早期模型的167個(gè)分子覆蓋116個(gè))，人群覆蓋率擴(kuò)大到96%，如圖6D所示。

圖5 HLA-DP特異性分布樹

圖6 整合額外DP數(shù)據(jù)集后的分子覆蓋率

預(yù)測方法模型的其他性能測試

01
使用包括多肽編碼在內(nèi)的反轉(zhuǎn)模型對該方法進(jìn)行了重新訓(xùn)練，觀察到在所有三個(gè)HLA-II基因座 (DR、DP和DQ)中性能顯著提高， HLA-DQ改善最多(AUC、AUC 0.1和PPV分別增加3.5、9.4和5.8個(gè)百分點(diǎn)，見圖S9)。

圖S9 多肽編碼模型重訓(xùn)練

使用上述方法模型進(jìn)一步分析對HLA-DR和HLA-DQ的預(yù)測能力。通過繪制每對分子(即DRB1與DRB3, DRB1與DRB4, DRB1與DRB5)的DR肽注釋分?jǐn)?shù)在每個(gè)數(shù)據(jù)集中的分布，發(fā)現(xiàn)在含有DRB1和DRB5的樣品中，DRB5總體上具有較高的肽貢獻(xiàn)(見圖S10A)。另一方面，DRB4的貢獻(xiàn)最低，而DRB3的貢獻(xiàn)不太一致，說明DRB3基因具有更多的多態(tài)性。這些結(jié)果與Kaabinejadian等人^[10]的發(fā)現(xiàn)非常吻合，再次說明了在基序解卷積過程中包含完整HLA-DR分型以準(zhǔn)確表征DR配體的重要性。此外，分析了DQ雜合數(shù)據(jù)集的基序解卷積以及HLA-DQ和β鏈配對在形成免疫肽丘中的作用。如圖S10B所示，反式組合在所有DQ-雜合數(shù)據(jù)集中的貢獻(xiàn)始終較低，DQ-MA數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)的順式變異的貢獻(xiàn)明顯高于反式變異。然而，我們觀察到DQ-SA數(shù)據(jù)集中存在的順式變異比DQ-MA數(shù)據(jù)集中存在的順式變異的總體貢獻(xiàn)更高，表明對這些分子的潛在偏好。

圖S10

構(gòu)建了一個(gè)結(jié)合HLA- DR、HLA- DP和HLA- DQ分子的特異性樹以評估整個(gè)HLA II類特異性覆蓋�；趥涡蛄兄g的相似性，得到53個(gè)具有獨(dú)特特異性的DR分子，40個(gè)DP分子和24個(gè)DQ分子。然后，使用MHCCluster方法構(gòu)建這些分子的總體特異性樹。其結(jié)果如圖7所示�？傮w來看，每個(gè)位點(diǎn)上的分子被分在一組，形成定義明確的簇。也有少數(shù)例外，DRB4*01:01單獨(dú)定位在DQ分支附近，DPA1*01:03-DPB1*271:01與一組DR分子聚集在一起。后者很可能是由于這個(gè)DP分子在肽覆蓋和偽序列距離方面都沒有被目前的方法覆蓋。

圖7 HLA- DR、HLA- DP和HLA- DQ分子的特異性樹

作為對NetMHCIIpan-4.3的最終驗(yàn)證，對其在CD4+表位鑒定中的性能進(jìn)行了基準(zhǔn)測試。結(jié)果如圖8所示，NetMHCIIpan-4.3顯著優(yōu)于MixMHC2pred-2.0和NetMHCIIpan-4.2 。

圖8 CD4+表位基準(zhǔn)測試

總結(jié)

經(jīng)過對多重?cái)?shù)據(jù)多種模型的優(yōu)化與驗(yàn)證，最終將該預(yù)測模型整合形成NetMHCIIpan-4.3工具，有效地縮小了HLA- DP/HLA- DQ和HLA- DR之間的性能差距，從而增強(qiáng)了所有三個(gè)HLA II類位點(diǎn)的基序特征。借助NetMHCIIpan-4.3，HLA II類分子的特異性難題可以得到解決，有望拓寬我們對所有HLA II類在感染性和自身免疫性疾病中啟動(dòng)細(xì)胞免疫的分子作用機(jī)制，而不僅僅是HLA- DR。

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